E-鈣黏素和β-連環(huán)蛋白在小鼠角膜上皮損傷修復中的表達變化和黏附增殖作用.pdf

1、目的:通過角膜上皮刮除，建立角膜損傷模型，探討E-cadherin和β-catenin在小鼠角膜創(chuàng)傷愈合過程中的表達變化和對創(chuàng)傷愈合的作用，并對兩者之間的相互作用及與此可能相關的信號轉導通路做初步研究。 方法:選擇6．8周的C57BL/6J小鼠，通過刮除角膜上皮，制作角膜損傷模型。將角膜損傷后的小鼠根據時間隨機分成7組，分別為損傷后3h、6h、9h、12h、18h、24h和48h組。對角膜進行熒光素染色，在裂隙燈下觀察、照相，并

2、用Leica QWin軟件計算角膜損傷面積。光、電鏡下觀察角膜組織結構。AE5免疫熒光染色，并結合流式細胞術，對角膜上皮刮傷修復過程中的細胞進行系統(tǒng)的觀察與分析。用RT-PCR和免疫熒光染色檢測正常小鼠角膜組織中E-cadherin和β-catenin的表達。通過Real-time PCR和Western Blot方法檢測損傷后不同時間點E-cadherin和β-catenin的mRNA、全蛋白和胞漿蛋白表達變化情況。采用免疫熒光染色法

3、檢測β-catenin和磷酸化β-catenin(Ser33/37/Thr41)分布特點。Real-time PCR檢測Cx43的表達變化，RT-PCR檢測PCNA及Cyclin D1的mRNA表達情況。 結果:熒光素染色、HE和電鏡顯示角膜上皮刮除后6h，細胞開始遷移，創(chuàng)口損傷面積開始顯著減小，到24h創(chuàng)口基本再上皮化，48h上皮形態(tài)和連接結構恢復到正常。AE5熒光染色顯示覆蓋創(chuàng)口區(qū)域的細胞均呈陽性免疫反應。流式細胞術可見凋亡

4、率在6h達到最高值，以后凋亡率逐漸下降，至損傷后24h基本趨于正常。細胞周期分析示S期細胞在9h開始增多，至24h達到頂峰，觀察的24h內只發(fā)生一次增殖。E-cadherin和β-catenin mRNA在正常小鼠角膜中有表達。免疫熒光染色顯示E-cadherin主要表達在角膜上皮細胞胞膜，β-catenin在角膜的上皮、基質和內皮層均有表達。Real-time PCR顯示，損傷后3h E-cadherin和β-catenin表達均升高

5、，并達最高，之后持續(xù)下降。Western Blot顯示，E-cadherin蛋白在損傷后3h～18h均比正常低，至24h表達開始增多，48h蛋白表達明顯增多。β-catenin全蛋白在損傷后3h到12h表達沒有明顯變化，18h到48h蛋白表達增多。β-catenin胞漿蛋白在6h和9h增多后，12h和18h減少，至24h和48h又增多。磷酸化β-catenin(Ser33/37/Thr41)損傷后6h表達呈陽性，9h上皮細胞表達增強，細

6、胞質呈強染，損傷后18h至48h恢復到正常水平。β-catenin在損傷后18h起至48h角膜上皮細胞紅色熒光增強，并且出現(xiàn)細胞質和細胞核表達。Real-time PCR顯示，Cx43在損傷后6h表達開始明顯下降，12h降到最低點，18h至48h開始持續(xù)上升。RT-PCR顯示，PCNA mRNA表達水平在損傷后3h就開始明顯下降，6h達最低點，9h開始有所升高，48h達正常水平。Cyclin D1 mRNA表達水平在損傷后3h下降，12

7、h稍有所上升，18h～24h又下降，48h上升達正常水平。 結論:制作的小鼠角膜上皮刮除模型損傷面積較均一，具有可重復性，角膜上皮能完全修復，模型制作成功，能用于對角膜上皮損傷修復過程的研究。整個修復過程經歷細胞遷移覆蓋創(chuàng)面，上皮化后細胞增殖，再復層化。在損傷早期能引起E-cadherin和β-catenin mRNA表達增加，損傷晚期E-cadherin和β-catenin蛋白合成增加。E-cadherin在損傷早期蛋白表達降