RNAi干擾HPV16 E6基因對宮頸癌Siha細胞的影響.pdf

1、子宮頸癌是威脅婦女健康的第二大惡性腫瘤。近年來發(fā)病率不斷上升,尤其是在發(fā)展中國家。每年大約有46萬新發(fā)病例,大約27.4萬患者死于子宮頸癌,且發(fā)病有年輕化趨勢。子宮頸癌的發(fā)生是一個由癌前病變逐漸衍變?yōu)榘┑拈L期、連續(xù)的病理過程,目前流行病學和實驗室研究數(shù)據均顯示HPV感染是子宮頸癌的主要致病因素,尤其是高危型HPV感染與子宮頸癌高度相關。HPV16型是高危型人類乳頭瘤病毒中最常見的類型之一,其早期蛋白E6及E7在宮頸鱗狀上皮細胞惡性轉化及

2、惡性表型維持中均扮演著非常重要的角色。E6蛋白可與細胞內的E6相關蛋白(E6AP)形成E6/E6AP復合體,并與P53蛋白結合,E6AP將活化的泛素連接到P53蛋白,通過泛素介導的泛素途徑使P53蛋白降解；E7與生長抑制蛋白pRB結合,使pRB蛋白磷酸化,釋放轉錄因子E2F,使感染細胞得以實現(xiàn)基因轉錄、增殖。抑癌基因P53、pRB的下調,可激活端粒酶,阻斷干擾素的產生,增加外源DNA的整合及突變,抵抗細胞凋亡,最終導致癌變。RNA干擾(

3、RNA interference,RANi)技術是近年來新發(fā)展的一項以一個特異的mRNA降解為目標的基因沉默技術,RNAi不僅具有更高的基因特異性,而且抑制效率及抑制穩(wěn)定性均比核酶或反義核酸要高。我們采用RNAi技術沉默宮頸癌Siha細胞株中HPV16 E6基因的表達,以觀察HPV16 E6沉默后對宮頸癌Siha細胞的生長及細胞凋亡的影響,為探索高危型人類乳頭瘤病毒導致宮頸癌發(fā)生的機制研究提供新的理論依據,以期為宮頸癌的基因治療尋找新的

4、思路。
　　 目的:
　　 利用RNA干擾(RNAi)技術,使用基因特異性的靶向于HPV16 E6基因的小干擾RNA(SiRNA)作用于HPV16 E6陽性的宮頸癌細胞株SiHa,沉默宮頸癌Siha細胞的HPV16 E6基因,通過檢測干擾組與未干擾組之間HPV16 E6 mRNA及蛋白的變化、抑癌蛋白P53的變化,以及各組之間Siha細胞凋亡率的改變,探討HPV16 E6 SiRNA對HPV16陽性SiHa細胞E6基因的

5、特異性抑制作用,以及對細胞凋亡的影響,為探索高危型人類乳頭瘤病毒導致宮頸癌發(fā)生的機制研究提供新的理論依據,為使用RNAi技術治療宮頸癌的可行性提供實驗基礎。
　　 方法:
　　 (1)SiRNA序列的構建:根據SiRNA的設計原則和GenBank中HPV16 E6cDNA序列,應用Ambion公司的在線設計軟件,分別在其序列不同位點針對HPV16 E6設計兩對DNA片段,并分別連接至pSilencerTM 3.1-H1

6、hygro,構建兩對小干擾RNA:SiRNA-109(S Ⅰ)及SiRNA-142(S Ⅱ),以及通用陰性對照NC(NegativeControl)和陽性對照SiRNA:GAPDH(Human GAPDH)SiRNA,均帶熒光標記綠色熒光蛋白(FAM)。測序結果顯示構建的兩對SiRNA序列與設計的DNA序列完全一致。由上海吉瑪制藥技術有限公司設計并合成。
　　 (2)細胞培養(yǎng)與轉染:SiHa細胞用含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng),

7、培養(yǎng)條件為37℃、5％CO2。于轉染前24d'時鋪至6孔板,培養(yǎng)至細胞30-50％融合時使用LipofectamineTM2000脂質體轉染。實驗分5個組:空白對照組(未轉染組)、脂質體組(LIPO對照組)、陰性對照SiRNA轉染組(NC轉染組)、SiRNA-109轉染組(SⅠ轉染組)、SiRNA-142轉染組(S Ⅱ轉染組)。以脂質體6μl:SiRNA100pmol比例進行轉染,按照轉染試劑盒說明書操作,于OPTI MEMI中培養(yǎng)6小

8、時后換完全培養(yǎng)基。
　　 (3)RT-PCR檢測HPV16 E6基因表達:以GAPDH做為內參,由上海生工生物技術服務公司合成引物,參照TAKARA逆轉錄試劑盒要求的條件進行反轉錄。PCR反應條件:預變性94℃ 3min,94℃ 30s,58℃ 45s,72℃ 45s,32個循環(huán),72℃1min。取反應產物行瓊脂糖凝膠電泳,觀察目的條帶、攝片并應用灰度分析軟件分析。
　　 (4)Western Blot檢測蛋白表達:于轉

9、染后48h收獲各組細胞各約1×106個,蛋白裂解液裂解蛋白,變性,10％SDS-PAGE電泳,濕法轉印PVDF膜,TBST漂洗后,5％脫脂奶粉封閉,分別與P53、HPV16 E6及GAPDH一抗、二抗孵育,ECL顯色,應用灰度分析軟件分析。
　　 (5)流式細胞儀檢測細胞凋亡:于轉染后48 h,各組細胞分別消化、離心收集。PBS洗滌細胞后,加入annexin V孵育30min,加PI至終濃度為50mg/L,用流式細胞儀檢測。

10、r>　　 (6)統(tǒng)計學分析:采用SPSS13.0軟件統(tǒng)計分析,服從正態(tài)分布的計量資料采用均數(shù)±標準差((x)±s)表示,采用one-way ANOVA方差分析,組間多重比較采用LSD法分析,以P<0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結果:
　　 (1)轉染后Siha細胞內HPV16 E6 mRNA的表達變化:RT-PCR結果顯示,未轉染組、LIPO對照組、NC轉染組、S Ⅰ轉染組及S Ⅱ轉染組HPV16 E6mRNA

11、表達水平分別為0.711±0.023、0.729±0.071、0.741±0.042、0.109±0.028及0.126±0.007,各組間差異有統(tǒng)計學意義(F=202.864,P=0.000)。轉染后24h,SⅠ及S Ⅱ轉染組Siha細胞內HPV16 E6 mRNA表達水平比未轉染組分別減少了84.7％和82.3％,減少有統(tǒng)計學意義(分別為P=0.000,P=0.000)。
　　 (2)轉染后Siha細胞HPV16 E6及P5

12、3蛋白表達水平的變化:Western Blot結果顯示,未轉染組、LIPO對照組、NC轉染組、S Ⅰ轉染組及S Ⅱ轉染組HPV16 E6蛋白表達水平分別為1.734±0.013、1.587±0.122、1.753±0.077、0.668±0.074及0.646±0.018,各組間差異有統(tǒng)計學意義(F=182.275,P=0.000)；未轉染組、LIPO對照組、NC轉染組、S Ⅰ轉染組及S Ⅱ轉染組P53蛋白表達表達水平分別為0.428±

13、0.030、0.524±0.034、0.4954±0.037、1.477±0.112及1.5964±0.082,各組間差異有統(tǒng)計學意義(F=223.037,P=0.000)。同樣,Western blot檢測結果亦顯示,S Ⅰ轉染組及SⅡ轉染組HPV16 E6蛋白抑制率分別為61.5％及62.7％,減少均有統(tǒng)計學意義(分別為P=0.000,P=0.000)；S Ⅰ轉染組及S Ⅱ轉染組P53蛋白表達水平分別較未轉染組升高245％及273％

14、,增加均有統(tǒng)計學意義(分別為P=0.000,P=0.000)。
　　 (3)轉染后Siha細胞凋亡的變化:轉染后48小時,流式細胞學分別檢測未轉染組、LIPO對照組、NC轉染組、S Ⅰ轉染組及SⅡ轉染組凋亡率。結果顯示:未轉染組凋亡率為6.700±0.243；LIPO對照組凋亡率為6.273±0.780；NC轉染組凋亡率為5.963±1.212；S Ⅰ轉染組凋亡率為34.387±3.140；SⅡ轉染組凋亡率為11.243±1.8

15、76。各組間細胞凋亡率的差異有統(tǒng)計學意義(F=143.806,P=0.000)。組間比較,S Ⅰ轉染組與未轉染組相比細胞凋亡率顯著增加,增加有統(tǒng)計學意義(P=0.000)；SⅡ轉染與未轉染組相比細胞凋亡率顯著增加,增加亦有統(tǒng)計學意義(P=0.010)；S Ⅰ轉染組與S Ⅱ轉染組細胞凋亡率的差異亦有統(tǒng)計學意義(P=0.000)。
　　 結論:
　　 通過利用SiRNA介導的基因干擾的手段可以有效下調宮頸癌Siha細胞中HP