HIF-1α長效抑制載體的構建及對食管癌細胞光動力效應的影響.pdf

1、背景：食管癌是我國消化道惡性腫瘤之一,死亡人數(shù)約占全部惡性腫瘤死亡人數(shù)的1／4,居惡性腫瘤死亡率第四位,僅次于肝癌,肺癌,和胃癌。目前認為早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期治療是提高食管癌治療效果的關鍵。早期治療中臨床手術治療是食管癌的主要治療手段之一,但切除后復發(fā)和遠處轉移嚴重影響了食管癌患者的治愈率和生存率。放療和化療雖療效肯定,但其副作用嚴重影響患者生存質量。光動力學療法(Photodynamic therapy,PDT)利用光敏劑和合適波

2、長的光,近20多年已應用于許多腫瘤的臨床治療,包括食管癌癌前病變、早期癌根治治療,晚期癌姑息性治療。但是仍存在許多患者對PDT應答的敏感性低下,并已成為臨床食管癌光動力治療的難題之一,因此弄清影響食管癌光動力學療效的因素及其作用機制將有助于尋找提高PDT臨床療效的新方法和新思路并針對不同腫瘤患者制定合理的個體化治療方案,從而提高患者療后生存率。
　　 以往的研究提示多種因素能夠影響PDT效果,這些因素除所選用的光敏劑、光波長和氧

3、分子以外,還包括腫瘤細胞的生物性狀(如細胞分化狀態(tài))、機體的免疫狀態(tài)、細胞內某些促凋亡基因和抑凋亡基因的表達水平與活性水平等。由于光動力學效應需依賴分子氧的存在,氧分子的缺乏能夠導致單態(tài)氧產量不足,因而PDT效果下降。但在多數(shù)實體腫瘤中往往存在低氧狀態(tài)。實體瘤組織的缺氧導致缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)的泛素介導蛋白酶體降解過程受到抑制,細胞內水平增加。HIF-1α作為一種轉錄因子,能激活多種基因的表達,如促紅細胞生成素(EPO)、

4、血管內皮生長因子(VEGF)、多藥耐藥基因(MDR1),還有一些與能量代謝有關的酶類,均與細胞存活、增殖、血管生成、侵襲、耐藥等相關,因而HIF-1α有可能影響到臨床PDT的療效。除此之外,據(jù)報道證實HIF-1α也與細胞凋亡相關,由于PDT對腫瘤細胞殺傷的重要機制之一就是誘導細胞凋亡,推測HIF-1α的表達水平有可能影響到PDT的殺傷效應,因而蛋白HIF-1α的表達狀況對PDT效應的影響及其作用機制是我們研究的重要內容之一。
　　

5、 本研究利用化學誘導法建立食管癌細胞缺氧模型,并構建能長效抑制蛋白HIF-1α表達的抑制載體,了解蛋白HIF-1α表達與食管鱗癌細胞PDT效應的關系,觀察HIF-1α蛋白抑制后對PDT細胞殺傷功能的影響,為臨床上通過調控基因表達而提高PDT的療效奠定理論和實驗基礎。
　　 本研究共分為以下兩部分:第一部分,長效抑制HIF-1α表達載體的構建鑒定和穩(wěn)定細胞株的篩選。第二部分,干擾HIF-1α蛋白誘導表達對食管癌細胞光動力學效應的

6、影響。
　　 目的：
　　 1,構建HIF-1α shRNA抑制載體,通過細胞穩(wěn)定轉染的方法建立長效抑制HIF-1α蛋白表達的食管鱗癌EC-9706細胞株,為研究其影響PDT效應的功能奠定基礎。
　　 2,觀察化學法誘導HIF-1α蛋白表達和干擾HIF-1α蛋白表達后對常氧條件培養(yǎng)的食管鱗癌細胞的細胞增殖的影響。
　　 3,研究蛋白HIF-1α誘導表達及阻斷HIF-1α蛋白誘導表達對食管鱗癌細胞PDT處理

7、后的細胞存活率與細胞凋亡率,明確HIF-1α的表達與食管鱗癌光動力學效應的關系。
　　 方法：
　　 1.根據(jù)siRNA干擾原理,利用WHITEHOUSE和siDirect在線設計軟件以及Rational siRNA Design軟件設計siRNA干擾序列。
　　 2.根據(jù)載體插入位點將siRNA干擾序列轉換為shRNA序列；將設計成功的干擾序列連入pENTRTM／H1／TO載體和pEZsiRNA6.1載體。

8、r>　　 3.利用脂質體轉染法將構建得到的有效干擾質粒載體轉染入食管鱗癌細胞(EC-9706細胞)中,應用倒置熒光顯微鏡的觀察,蛋白印跡法確定蛋白干擾效果。
　　 4.利用MTT法檢測抑制HIT-1α蛋白誘導表達細胞及對照細胞常氧時生長狀態(tài);對比觀察HIF-1α誘導表達及抑制誘導表達的細胞在PDT處理后的細胞存活率。
　　 5.利用流式細胞法檢測干擾HIF-1α蛋白表達前后細胞凋亡率。
　　 結果：
　　

9、 1.瞬時轉染及western blot結果表明設計的siRNA序列能夠明顯抑制HIF-1α蛋白的表達；以此siRNA序列設計出shRNA序列,連接載體,PCR和測序結果證實成功構建重組質粒pEZsiRNA6.1-hif-105；以此重組質粒轉染食管鱗癌細胞系,熒光顯微鏡觀察和western blot鑒定結果表明成功得到能抑制HIF-1α蛋白誘導表達的穩(wěn)定細胞系。
　　 2.化學誘導法成功建立了食管鱗癌缺氧細胞模型;常氧條件培

10、養(yǎng)穩(wěn)定細胞,干擾HIF-1α蛋白誘導表達組和未干擾HIF-1α蛋白誘導表達組細胞增殖曲線基本一致,無顯著性差異(P>0.05)。
　　 3.細胞CoCl2化學誘導后,PDT處理,干擾HIF-1α蛋白表達組(EC-9706-pEZsiRNA6.1-hif-105細胞)與未干擾HIF-1α蛋白表達組(EC-9706-pEZsiRNA6.1-neg細胞)細胞存活率分別為69.27％±5.21和88.36％±2.81,有顯著性差異(P<

11、0.01),表明HIF-1α蛋白的表達抑制了PDT作用效果。
　　 4.流式檢測PDT后的細胞凋亡,EC-9706-pEZsiRNA6.1-hif-105細胞組與EC-9706-pEZsiRNA6.1-neg細胞組早期凋亡率分別為29.31±2.75％和13.99±0.89％,有顯著性差異(P<0.05),提示HIF-1α蛋白抑制PDT對腫瘤細胞的殺傷作用,至少部分是通過抑制細胞凋亡而實現(xiàn)。
　　 結論：