大麗輪枝菌拮抗細菌RS-25菌株的分離鑒定、發(fā)酵及抗菌多肽的純化.pdf

1、由大麗輪枝菌(Verticillium dahliae Kleb.)引起的黃萎病是棉花的主要病害，嚴重影響棉花的生產，目前生物防治被認為是一種最具有發(fā)展?jié)摿Φ挠行Х乐畏椒ā?RS-25 菌株是從棉花根際土壤中分離到的一株產抗菌蛋白對大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)有拮抗活性并具有較廣抗菌譜的細菌。它所分泌的抗菌蛋白對立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)、尖孢鐮孢菌(Fusarium oxysp

2、orum)、串珠鐮孢菌(Fusarium moniliforme)、茁芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)等都具有較高的拮抗活性。 通過生理生化反應及16S rDNA基因序列分析對RS-25菌株進行了鑒定。生理生化反應顯示RS-25菌株大部分特征與解淀粉芽孢桿菌相似。將16S rDNA序列在NCBI網站中進行同源性比較，利用Neighbor-Joining法繪制系統(tǒng)發(fā)育樹，結果顯示RS-25菌株的16S r

3、DNA序列和數(shù)據庫中的AB325583菌株解淀粉芽孢桿菌的序列同源性達到99.62％。所以，結合生理生化反應及16S rDNA基因序列分析確定RS-25菌株為解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)。 為了提高 B.amyloliquefaciens RS-25菌株發(fā)酵產抗菌蛋白量，對B.amyloliquefaciens RS-25菌株發(fā)酵培養(yǎng)基所需的碳源、氮源、無機鹽進行了篩選，并采用正交試驗法

4、，對培養(yǎng)基的組成以及發(fā)酵條件進行了優(yōu)化，最終確定最適發(fā)酵培養(yǎng)基為:蔗糖2.0％，胰蛋白胨1.0％，KH2PO40.20％，CaCl2.2H2O 0.005％，MgS04.7H200.005％。最適發(fā)酵條件為:培養(yǎng)基初始pH 7.5，接種量4％，種齡10 h，培養(yǎng)基裝液量30 mL/250 mL，于28℃，180 r-min-1搖床振蕩培養(yǎng)48 h。經過發(fā)酵優(yōu)化抑菌圈直徑增加了25.4％。 B.amyloliquefaciens

5、RS-25菌株分泌的抗菌蛋白經DEAE Sepharose Fast Flow陰離子交換層析和反相層析后，分離純化到單一抗菌多肽A2，經SDS-PAGE檢測分子量約為9 kDa?？咕嚯腁2對熱穩(wěn)定；對蛋白酶不敏感；pH活性范圍較寬，在pH 6～8范圍內抑菌活性最強，在堿性條件下穩(wěn)定，在強酸性條件下抑菌活性消失?？咕嚯腁2含有糖基，含糖量為1.81％。 經EDMAN降解法對抗菌多肽A2的N端15個氨基酸殘基序列進行測定，結果顯

6、示為H2N-Ala-Ser-Gly-Gly-Thr-Val-Gly-Ile-Tyr-Gly-Ala-Asn-Met-Arg-Ser。以此為靶序列在NCBI網站中用BlastP程序對蛋白質序列數(shù)據庫進行了類似性檢索，發(fā)現(xiàn)其與來源于Bacillus amyloliquefaciens FZB42所報道的蛋白質序列的42～56位置的氨基酸殘基序列100％同源?？咕嚯腁2的部分序列測定為抗菌蛋白基因克隆奠定了基礎同時為棉花黃萎病抗病基因工程提