茶樹花多糖的提取、純化、結構鑒定及生物活性的研究.pdf

1、茶樹花富含營養(yǎng)成分和活性物質,是一類具重要的潛在資源。本文在系統(tǒng)研究茶葉多糖分離純化、理化性質和一級結構的基礎上,利用生物大分子研究的近代最新技術和現(xiàn)代分離、分析手段與藥理實驗方法,表征茶樹花多糖的溶液行為和三維鏈構象,嘗試揭示多糖的高級結構與其重要生物活性的關系。
　　 茶樹花多糖的提取主要包括茶樹花多糖提取條件的優(yōu)化和茶樹花多糖脫蛋白,脫色等方法的選擇。采用單因素實驗和Box-Behnken中心組合設計實驗,確定了熱水提取茶

2、樹花多糖最佳提取條件:21.75倍量水,90℃提取1.89h。通過綜合考量Sevag法、三氯乙酸法、鹽酸法和氯化鈣法的脫蛋白率和多糖保留量,確定了以Sevag法作為茶樹花多糖脫蛋白的方法。實驗還比較了活性炭吸附法,H2O2氧化法和溶劑洗滌法的脫色效果,活性炭吸附法能夠得到較高的脫色率和多糖保留量。經Sephadex G-100凝膠柱層析分離得到多糖組分TFP-1和TFP-2,冷凍干燥后為灰白色粉末,多糖含量為83.6％和87.9％,蛋白

3、含量為1.5％和2.9％,糖醛酸含量為2.7％和7.1％。
　　 高效液相凝膠色譜法分析茶樹花多糖組分TFP-1和TFP-2,得到TFP-1的分子量為167.5kBa,單糖組成葡萄糖:木糖:鼠李糖:半乳糖=1.0:1.2:0.81:0.98。TFP-2分子量為10.1kDa,單糖組成葡萄糖:木糖:鼠李糖:阿拉伯糖=1.0:0.76:2.3:2.3。多糖的初步分析顯示,TFP-1和TFP-2是水溶性、非淀粉、非酚類物質,不含還原糖

4、和核酸、含有蛋白質的多糖。β-消去反應表明TFP-1和TFP-2中糖鏈與蛋白質之間通過0-糖肽鍵相連。通過紅外光譜分析得出TFP-1和TFP-2具有典型的糖類化合物的光譜特征,TFP-1同時含有α-吡喃環(huán)以及β-吡喃環(huán)的特征吸收峰,而TFP-2只含有α-吡喃環(huán)的特征吸收峰。1H NMR中的化學位移顯示TFP-1含有α-D-Galp、α-D-GalpNAc、α-D-Xylpα-D-Glcp和β-D-Glcp殘基。而TFP-2含有αL-Ar

5、ap、α-D-Glcp、α-D-Xylp和α-D-GlcpNAc殘基。
　　 原子力顯微鏡(AFM)的圖像顯示,茶樹花多糖鏈分子間互相纏繞,在濃度為5μ g／mL下TFP-1和TFP-2直徑為250hm和150hm,在濃度為20μ g／mL時直徑增加為500nto和200hm。茶樹花粗多糖TFP及組分TFP-1和TFP-2在水溶液中表現(xiàn)為剪切變稀,在相同的剪切速率下,茶樹花多糖溶液枯度TFP>TFP-1>TFP-2。通過激光光散

6、射、粘度測定和剛果紅反應等方法確定了茶樹花多糖在0.1MNaCl水溶液中呈現(xiàn)球狀構象,且分枝較多。pH值、溫度、離子強度等環(huán)境因素的改變均影響其立體構象。掃描電鏡SEM觀察和X-射線衍射分析表明TFP-1和TFP-2為無定形結構,提示多糖的空間結構和溶液行為將明顯影響多糖的生物活性。
　　 系統(tǒng)的研究了茶樹花多糖的體外和體外抗氧化活性。通過比較茶樹花粗多糖TFP及組分TFP-1和TFP-2對羥基自由基,超氧陰離子自由基以及DPP

7、H自由基的清除活性,得出抗氧化活性TFP-2>TFP-1>TFP,這可能與組成多糖的成分及水溶性和粘度有關。灌胃茶樹花多糖(75、150和300mg／kg>28d后可抑制溴化苯誘導的小鼠肝臟脂質過氧化,能顯著提高小鼠SOD活性和T-AOC水平,并且抑制MDA含量的升高。
　　 灌胃茶樹花多糖(75、150和300mg／kg)14d后能顯著增加正常小鼠巨噬細胞的吞噬活性,對二硝基甲苯誘導的小鼠遲發(fā)型超敏反應也有顯著的增強。對S18

8、0肉瘤小鼠的研究發(fā)現(xiàn),灌胃TFP(75、150和300Mg／kg)7d后能顯著改善荷瘤小鼠生活狀況,顯著增加荷瘤小鼠生存時間和存活率,抑瘤率分別為45.5％,60.9％和64.5％。能顯著增加荷瘤小鼠血清中IFN-γ和IL-2含量的影響,并且能增加T細胞亞群CD4+的數(shù)量及改善CD4+／CD8+的失調,提示攝入茶樹花多糖可明顯增強免疫活性。
　　 茶樹花多糖對四氧嘧啶引起的小鼠實驗性糖尿病有明顯的防治作用。灌胃茶樹花多糖(75、