中分子量神經(jīng)絲亞單位單克隆抗體的制備及初步應用.pdf

1、目的:制備抗神經(jīng)絲中分子量亞單位(NF-M)的單克隆抗體(McAb)，為神經(jīng)絲檢測方法的建立奠定基礎。
　　 方法:將人、大鼠、小鼠NF-M氨基酸序列進行比對，選擇合適的氨基酸序列GNPSAYRRVTETRSSFSRVSGSPSSGFRSQSWSRGSP-C進行多肽合成，合成后的多肽通過Sulfo-SMCC與匙孔槭血藍蛋白(KLH)載體蛋白偶聯(lián)。將偶聯(lián)后的多肽KLH-NF-M作為抗原，以腹腔注射的方式免疫BALB/c小鼠。首次免

2、疫使用福氏完全佐劑乳化抗原，其后的免疫使用福氏不完全佐劑乳化，每隔2周免疫一次。多次免疫后，小鼠內(nèi)眥取血，離心取血清。以NF-M多肽包被酶標板，用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定小鼠外周血中抗體效價。選擇血清抗體效價高的小鼠，進行脾內(nèi)免疫，3天后處死小鼠，取其脾細胞。采用細胞融合技術，PEG4000為融合劑，將小鼠脾細胞和小鼠骨髓瘤細胞（sp2/0細胞）融合。使用HAT培養(yǎng)基篩選雜交瘤細胞。ELISA檢測雜交瘤細胞培養(yǎng)上清中McAb，

3、對分泌抗NF-M的McAb的細胞株以有限稀釋法進行克隆化。獲得能穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株。以競爭抑制，免疫學方法對該McAb亞類進行鑒定。以NF-M多肽為競爭抗原應用競爭抑制試驗檢測McAb的特異性。將正常大鼠大腦組織勻漿后上樣，進行SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，以雜交瘤細胞產(chǎn)生的抗體為一抗，進行Westernblot試驗，檢測抗體與大腦組織中的NF-M特異性結合的能力。以正常大鼠大腦作石蠟切片，以雜交瘤細胞產(chǎn)生的抗

4、體為一抗，進行免疫組化試驗，進一步鑒定該單克隆抗體的特異性。
　　 結果:BALB/c小鼠經(jīng)腹腔免疫4次后，ELISA檢測血清抗體效價為1(∶)512000。經(jīng)細胞融合后，融合率為46.61％，ELISA檢測抗體陽性率7.26％。對分泌抗NF-M的陽性細胞株有限稀釋法克隆化3～5次后，單克隆孔抗體分泌陽性率達到100％，建立了一株能穩(wěn)定分泌抗NF-M的雜交瘤細胞株2C1。經(jīng)單克隆抗體亞類鑒定2C1所產(chǎn)生的抗體為IgG1。多肽競爭

5、抑制結果:競爭抑制曲線為y=-0.4127x+0.2691，相關系數(shù)r=0.9912，證明McAb是針對NF-M的。Westernblot實驗在160KD分子量附近可見一條清楚的蛋白條帶，與NF-M分子量大小相符。表明該McAb與正常大鼠大腦勻漿中的NF-M蛋白有較好的特異性反應。正常大鼠大腦及脊髓石蠟切片的免疫組化結果顯示，神經(jīng)元胞核周圍棕褐色著色顆粒，表明該McAb與正常大鼠大腦切片組織中的NF-M有特異性反應。
　　 結論