辛硫磷與氰戊菊酯對體外培養(yǎng)大鼠卵巢顆粒細胞類固醇激素合成的影響及其機制探討.pdf

1、第一部分辛硫磷與氰戊菊酯對體外培養(yǎng)rGCs類固醇激素合成的影響.為了探討Fen與Pho單劑對激素合成以及激素合成酶mRNA和蛋白表達的影響,我們采用無血清培養(yǎng)的rGCs作為模型.rGCs取自未成年Sprague-Dawley大鼠(20-25天齡),細胞分離培養(yǎng)方法參見文獻并稍作修改.細胞接種于培養(yǎng)板中后,Fen及Pho分別以不同的濃度(0,1,5,25,125和625μmol/L)進行染毒,染毒時間為24h.根據不同的實驗設計,在部分培

2、養(yǎng)液中加入卵泡刺激素(FSH)500μg/L、forskolin 10μmol/L、22(R)-羥膽固醇(22R-HC)25 μmol/L、蛋白激酶抑制劑(PKI)2μmol/L以及8-Bromo-cAMP 1 mmol/L.染毒結束后,收集培養(yǎng)上清凍存于-20℃?zhèn)溆?待測孕酮(P<,4>)和17β-雌二醇(E<,2>)濃度.細胞內cAMP采用無水乙醇法進行提取.另外的實驗中細胞總RNA及蛋白質也分別進行抽提以進行RT-PCR(或為re

3、al time PCR)以及Western'blot檢測.結果表明Fen與Pho均能干擾原代培養(yǎng)rGCs的激素合成,其機制可能涉及到了細胞內cAMP-依賴的蛋白激酶信號通路;同時,一些激素合成酶及相關蛋白(P450scc、StAR和P450arom)表達的改變可能也起了一定的作用.第二部分基因芯片技術分析體外培養(yǎng)rGCs經氰戊菊酯處理后基因表達的變化.為了解經Fen處理后rGCs內基因變化的情況,我們從處理后的細胞中抽提出總RNA,然后

4、用Affymetrix Genechip RAT 230A寡核苷酸芯片進行基因表達譜掃描.rGCs的染毒劑量為25μmol/L,對照組培養(yǎng)液中加入0.1﹪無水乙醇.染毒后根據不同的時間段于6h、12h和24h收集細胞,抽提純化總RNA,并進行一系列的處理,然后與約含15900個大鼠表達基因的RAT 230A芯片進行雜交.與對照組相比,所有處理組內表達變化超過2倍的上調基因數目分別為:6h,168個基因;12h,97個基因;24h,140