LRP16對HeLa細(xì)胞的放化療敏感性的影響及其機(jī)制.pdf

1、DNA損傷是對于細(xì)胞穩(wěn)定性和基因完整性的主要威脅之一。細(xì)胞的損傷應(yīng)答機(jī)制對于細(xì)胞的存活和防止腫瘤的形成非常重要。DNA損傷常涉及多種應(yīng)答方式，包括有DNA損傷修復(fù)，細(xì)胞周期關(guān)卡，凋亡通路等。在各種 DNA損傷形式中，DNA雙鏈損傷(DNA double-strand breaks，DSB)最具細(xì)胞毒性作用，可由電離輻射(ionizing radiation，IR)、拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ或Ⅱ的抑制劑，和代謝過程中形成的氧自由基等誘導(dǎo)發(fā)生。LRP1

2、6屬于Macro domain家族蛋白成員之一，研究證實它與多種腫瘤細(xì)胞的放化療抵抗有關(guān)。本室先前的結(jié)果證實內(nèi)源性的LRP16與NF-κB的亞單位之一p65之間有相互作用，在 TNF-α存在條件下，抑制LRP16內(nèi)源性表達(dá)，可以顯著抑制NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性。
　　我們主要研究在電離輻射和依托泊苷(ETO)誘導(dǎo)條件下，LRP16對細(xì)胞的放化療抵抗的調(diào)控作用。
　　方法：首先，通過單細(xì)胞凝膠電泳(SCGE)實驗檢測LRP16對于

3、DNA損傷的作用，進(jìn)一步采用Western Blot檢測γH2Ax的表達(dá)水平來驗證LRP16對DNA損傷的作用。之后分別通過CCK-8法和AnnexinV標(biāo)記與流式細(xì)胞計數(shù)的方法檢測了LRP16對細(xì)胞活力和凋亡的影響。最后通過RT-PCR法檢測NF-κB下游靶基因的轉(zhuǎn)錄水平。
　　結(jié)果：LRP16表達(dá)的增加下調(diào)了電離輻射和依托泊苷誘導(dǎo)的HeLa細(xì)胞損傷程度，抑制了DNA損傷修復(fù)；LRP16能夠抑制IR和ETO誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用；在

4、抑制內(nèi)源性LRP16的表達(dá)條件下，細(xì)胞的凋亡率顯著增加；但過表達(dá)LRP16時，存在細(xì)胞種類差異，并且對不同損傷誘導(dǎo)因子作用下，對其凋亡率的影響也存在差異。通過RNA干擾技術(shù)沉默HeLa細(xì)胞中內(nèi)源性LRP16的表達(dá)可以降低NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性，下調(diào)了其下游凋亡相關(guān)靶基因。
　　結(jié)論：本研究表明LRP16能增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對放化療的抵抗作用，這可能是通過調(diào)控NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性來實現(xiàn)的。
　　第一部分 LRP16對HeLa細(xì)胞DNA

5、損傷的影響
　　目的：研究LRP16基因的表達(dá)與HeLa細(xì)胞的DNA損傷程度的相關(guān)性
　　方法：1.通過轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pCDNA3.1-LRP16實現(xiàn)LRP16的過表達(dá)，蛋白印跡實驗檢測蛋白表達(dá)水平；2.用單細(xì)胞凝膠電泳法(SCGE)，通過CASP軟件分析OTM值和tail length兩個指標(biāo)；3.采用細(xì)胞流式技術(shù)檢測各組細(xì)胞中γH2AX表達(dá)量。
　　結(jié)果：1.蛋白印跡實驗結(jié)果示：轉(zhuǎn)染了pCDNA3.1-LRP16的HeL

6、a細(xì)胞LRP16的表達(dá)量與空質(zhì)粒 pCDNA3.1相比明顯增高；2.采用圖像軟件CASP分析SCGE結(jié)果：分別用IR或ETO處理細(xì)胞后，LRP16過表達(dá)組與空質(zhì)粒相比，OTM值和tail length兩個指標(biāo)的值有統(tǒng)計學(xué)差異(p<0.05)3.流式細(xì)胞檢測結(jié)果：分別用IR或ETO處理細(xì)胞后，LRP16過表達(dá)組與空質(zhì)粒相比，超過預(yù)設(shè)熒光強(qiáng)度值的細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)百分比差異顯著(P<0.05)。
　　結(jié)論：外源性增加LRP16的表達(dá)量能

7、夠抑制電離輻射和依托泊苷誘導(dǎo)的DNA損傷，其機(jī)制是抑制了H2AX的磷酸化過程。
　　第二部分 LRP16對HeLa細(xì)胞的放化療敏感性的影響
　　目的：探討LRP16對電離輻射或依托泊苷誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響。
　　方法：1.將抑制LRP16表達(dá)的小干擾RNA，control siRNA，siRNA-374，siRNA-668，分別轉(zhuǎn)染入HeLa，H1299，MCF-7細(xì)胞內(nèi)，并通過電離輻射或依托泊苷處理的細(xì)胞；

8、用CCK-8檢測細(xì)胞活力；用DAPI染色和流式細(xì)胞技術(shù)測定抑制LRP16的表達(dá)對HeLa細(xì)胞的凋亡率的影響；2.將轉(zhuǎn)染了質(zhì)粒pcDNA3.1和pcDNA3.1-LRP16的分別轉(zhuǎn)染入HeLa，H1299，MCF-7細(xì)胞內(nèi)，并通過電離輻射或依托泊苷處理的細(xì)胞；用CCK-8檢測細(xì)胞活力；用流式細(xì)胞技術(shù)測定LRP16的表達(dá)對HeLa細(xì)胞的凋亡率的影響。3.通過RT-PCR檢測抑制LRPl6表達(dá)之后核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclearfactor-

9、κB，NF-κB)凋亡相關(guān)的下游靶基因的mRNA水平。
　　結(jié)果：在依托泊苷或者電離輻射的作用下，通過siRNA轉(zhuǎn)染抑制LRP16的表達(dá)使能夠明顯抑制HeLa細(xì)胞的增殖(p<0.05)。同時增加細(xì)胞的凋亡率(p<0.05)；然而，在過表達(dá)組，LRP16對HeLa，H1299，MCF-7細(xì)胞的凋亡率的影響并不一致。在HeLa和MCF-7細(xì)胞中，LRP16對凋亡無影響(p>0.05)；在H1299細(xì)胞中，LRP16的表達(dá)的上調(diào)促進(jìn)了細(xì)