基于VEGFR靶點的腫瘤靶向抑制肽的改造、篩選及鑒定.pdf

1、研究背景及目的
　　 腫瘤的生長、侵襲、轉(zhuǎn)移均依賴于血管生成，抗腫瘤血管生成具有良好的應用前景。血管內(nèi)皮細胞生長因子VEGF為最主要的血管生成促進因子，它通過與胞膜上的VEGF受體(VEGFR)特異結合而發(fā)揮促血管生成作用，其中VEGFR-1(Flt-1)及VEGFR-2(KDR)高表達于腫瘤細胞及新生的血管內(nèi)皮細胞，在其它細胞中極低表達或不表達，在腫瘤血管生成中處于核心地位，與腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移密切相關，阻斷VEGFR的功能可抑

2、制VEGF的促血管生成作用。因此，以VEGF/VEGFR為靶點開展的抗腫瘤血管生成研究成為當前的研究熱點之一。
　　 VEGF125-136為VEGF-A外顯子6編碼的12肽QKRKRKKSRYKS，能與VEGFR特異結合但不激活VEGFR，對VEGFR起封閉作用，從而競爭抑制VEGF的促血管生成，有望作為腫瘤核素靶向顯像或核素治療的侯選分子。
　　 上一國家自然科學基金課題(30400114)結果提示：①188Re-V

3、EGF125-136明顯靶向聚集于荷瘤裸鼠的腫瘤組織，抑制腫瘤生長；②腫瘤組織轉(zhuǎn)染截短KDR基因后，明顯增加了188Re-VEGF125-136在腫瘤部位的聚集量。即該標記物在腫瘤的靶向顯像及治療方面具有較好的應用前景，但它在腫瘤組織的滯留時間僅3小時。
　　 進一步提高標記物在腫瘤組織的聚積量(提高瘤/非瘤比值)與滯留時間，以增強抗腫瘤作用為本研究需要深入探討的重點。提高多肽與受體間的親和力是提高標記物在腫瘤組織聚積量與滯留時

4、間的有效途徑。配體與受體結合的可逆性是受體的最基本特性之一，而親和力是衡量配體-受體結合能力及穩(wěn)定性的重要參數(shù)：親和力越高，配體與受體越易結合，結合之后的復合物越穩(wěn)定，不易發(fā)生解離。
　　 本研究旨在探討VEGF125-136的改造及篩選目標多肽的方法，然后對目標多肽的99Tcm標記方法探討，標記多肽在荷瘤裸鼠的體內(nèi)分布及SPECT腫瘤靶向顯像，為進一步的腫瘤靶向顯像及靶向治療奠定實驗基礎。
　　 研究方法
　　

5、 1.多肽VEGF125-136的生物信息學改造：結合分子對接法及表面基團相互作用法對VEGF125-136進行改造，獲得理論上與VEGFR間具有更高親和力的多肽。
　　 2.體外受體競爭結合實驗驗證多肽與VEGFR的親和力，3H-TdR參入實驗驗證多肽對腫瘤細胞增殖的影響，從上述多條多肽中篩選得到目標多肽。
　　 3.目標多肽的放射性核素標記及鑒定：選用合適的雙功能螯合劑偶聯(lián)多肽，探討目標多肽的最佳標記條件，紙層析法和

6、HPLC法鑒定多肽的標記率、放射化學純度及體外穩(wěn)定性。半胱氨酸置換實驗驗證99Tcm與多肽的螯合能力。體外受體競爭結合實驗鑒定標記多肽的體外受體結合活性。
　　 4.標記多肽的藥代動力學研究：取日本大耳兔8只，每只經(jīng)左耳緣靜脈注射1mCi/200μl標記多肽，分別于注射后1.5、3、5、10、30、60、120、240、480min從右耳緣靜脈抽血測量血樣放射性濃度，應用藥物代謝動力學分析軟件(DAS3.0)分析多肽最佳方式模型

7、及示蹤動力學參數(shù)。
　　 5.標記多肽在正常昆明小鼠體內(nèi)分布研究：15只昆明小鼠經(jīng)尾靜脈注射標記溶液7.4MBq/200μl，分別于30min、1h、2h摘眼球法收集血液并將小鼠頸椎脫臼法處死，收集心、肝、脾、肺、腎、腦、胃、腸、甲狀腺、骨、肌肉，分別稱重并測放射性，經(jīng)參考源校正后計算每克組織百分注射劑量率(%ID/g)。
　　 6.日本大耳白兔顯像研究：耳緣靜脈注射標記溶液0.5mCi后立即以1幀/min采集60min

8、，并于90、120、180、240min預置計時5min采集圖像一幀，觀察各器官的放射性分布動態(tài)變化。
　　 7.標記多肽在荷瘤裸鼠體內(nèi)顯像及競爭抑制顯像研究：荷瘤裸鼠注射標記目標多肽物(11.1MBq/只)后0.5h、1 h、1.5h、2h、3h、4h行SPECT平面預置計時(10 min)顯像。注射目標多肽1mg后注射標記目標多肽物(11.1MBq/只)，0.5h、1h行SPECT平面預置計時(10 min)顯像，評價目標多

9、肽與腫瘤組織結合的特異性。
　　 實驗結果
　　 1.生物信息學方法改造VEGF125-136并經(jīng)體外實驗驗證獲得了兩條與VEGFR受體親和力高且可以明顯抑制腫瘤細胞增殖的多肽：QKRKRKKSRKKH、RKRKRKKSRYIVLS。
　　 2.目標多肽的放射性核素標記及鑒定：目標多肽選用HYNIC為雙功能螯合劑，標記方法如下：在2ml細胞凍存管中依次加入20μg多肽，HYNIC-QKRKRKKSRKKH50mg

10、Tricine，HYNIC-RKRKRKKSRYIVLS為80mgTricine，5mg TPPTS，100μL0.25mmol/L琥珀酸緩沖溶液(pH=5)，100μL Na99TcmO4185MBq，總體積200μL，充氮密封后100℃反應25min，自然冷卻至室溫。
　　 經(jīng)雙功能螯合劑HYNIC偶聯(lián)后的多肽QKRKRKKSRKKH、RKRKRKKSRYIVLS，標記率均>(94.13±1.77)。室溫下放置24h后，放化

11、純度仍高達90%。兩條多肽經(jīng)HYNIC修飾后抑制腫瘤細胞增殖能力與修飾前無明顯差異。
　　 兩條多肽經(jīng)HYNIC修飾并經(jīng)99Tcm標記后仍保持了良好的受體結合活性，能與靶細胞特異結合。
　　 3.99Tcm-HYNIC-QKRKRKKSRKKH在正常日本大耳兔體內(nèi)的藥物代謝動力學過程符合三室模型。99Tcm-HYNIC-RKRKRKKSRYIVLS在正常日本大耳兔體內(nèi)的藥物代謝動力學過程符合二室模型。
　　 4.

12、正常昆明小鼠體內(nèi)分布及日本大耳白兔體內(nèi)顯像示：兩條多肽具有親水性，主要通過腎臟經(jīng)泌尿系統(tǒng)排泄，血流清除快，在心、肝、脾、肺、腦、胃腸、甲狀腺、骨、肌肉等組織器官中分布較少。
　　 5.荷瘤裸鼠體內(nèi)顯像示：尾靜脈注射標記多肽后0.5h，腫瘤部位即可見明顯放射性濃聚，雙腎、膀胱可見明顯的放射性濃聚，而心臟、肺臟、肝臟、胃腸道、腦、頸部及肌肉組織均未見明顯放射性分布。競爭抑制顯像腫瘤部位未見明顯放射性濃聚。
　　 結論