紡錘絲毒性藥物誘導多倍體的形成機制及對藥物敏感性的影響——凋亡通路的初步研究.pdf

1、目的:
　　 腫瘤的化療是腫瘤綜合治療的重要組成部分。許多研究表明,化學藥物主要通過誘導腫瘤細胞的凋亡達到治療目的,能否誘導腫瘤細胞凋亡成為評價抗癌藥物療效的重要標志,但許多化療藥物都面臨著腫瘤細胞產(chǎn)生耐藥的問題。目前的研究多集中在多藥耐藥基因的表達與腫瘤耐藥間的關(guān)系,但有研究顯示多倍體腫瘤對常用的放療、化療極不敏感,而具有多倍體亞克隆的腫瘤預后更差。紡錘絲毒性藥物(紫杉醇/長春新堿/Nocodazole)是許多腫瘤化療的一線藥

2、物。由此提示我們這些紡錘絲毒性藥物誘導形成的多倍體很可能與腫瘤耐藥發(fā)生相關(guān)。
　　 通常正常細胞周期進程中如出現(xiàn)異常(如形成多倍體)會啟動凋亡通路。即使腫瘤細胞也存在多種正常的細胞周期調(diào)控機制。前期研究發(fā)現(xiàn),在用紡錘絲毒性藥物處理細胞時,有些細胞以發(fā)生凋亡為主,有些細胞以形成多倍體為主。為何一些細胞會出現(xiàn)有絲分裂滑動而導致多倍體(四倍體)的產(chǎn)生?為何這些多倍體細胞未激活細胞凋亡機制?分析起來可能與細胞周期的失調(diào)控和細胞凋亡通路受

3、到抑制有關(guān)。
　　 Bcl-2家族是哺乳動物細胞中調(diào)節(jié)凋亡的重要因子,目前研究認為Bcl-2基因及其相關(guān)蛋白高表達抑制細胞凋亡是腫瘤發(fā)生和產(chǎn)生耐藥現(xiàn)象的重要因素之一。因此,從凋亡的角度出發(fā)對Bcl-2、Bax在Nocodazole誘導多倍體腫瘤的發(fā)生和發(fā)展進行研究有較大的意義。
　　 是否凋亡通路的異常是導致多倍體形成的真正因為呢?又是那些分子在控制著凋亡通路呢?本實驗通過應用細胞有絲分裂阻滯劑Nocodazole為誘導

4、物,以兩株對該藥反應截然不同的乳腺癌細胞為研究對象(一株MDA-MB-231以形成多倍體細胞為特點,一株Hoc1806以凋亡為特點),在與藥物共同孵育的不同時間點收獲細胞,確定細胞周期并檢測細胞凋亡通路蛋白Bcl-2/Bax在Nocodazole誘導多倍體腫瘤形成中的表達,并初步探討了其可能的分子機制。
　　 方法:
　　 1、實驗分組:用Nocodazole處理兩株乳腺癌細胞系MDA-MB-231和HCC1806在藥物

5、作用后0h、6h、12h、24h、36h、48h、72h,根據(jù)不同時間點收獲細胞,并以不加藥細胞為空白對照。
　　 2、細胞周期的檢測:PI染色流式細胞儀檢測Nocodazole對MDA-MB-231和HCC1806細胞周期阻滯的影響,進行細胞周期分析,確定細胞周期。
　　 3、細胞凋亡的檢測:倒置顯微鏡和透射電子顯微鏡下分別觀察MDA-MB-231和HCC1806對照組,及Nocodazole處理后不同時間點收獲的MD

6、A-MB-231和HCC1806細胞后的形態(tài)學變化；PI染色流式細胞儀檢測Nocodazole對MDA-MB-231和HCC1806細胞凋亡的影響；WestenBlot檢測細胞凋亡執(zhí)行分子caspase9,caspase3的剪切情況。
　　 4、蛋白質(zhì)印跡法檢測MDA-MB-231和HCC1806對照組,及Nocodazole處理后不同時間點收獲的MDA-MB-231細胞和HCC1806細胞中Bcl-2家族抗凋亡蛋白Bcl-2和

7、促凋亡蛋白Bax的表達。
　　 結(jié)果:
　　 1、Nocodazole對MDA-MB-231和HCC1806細胞周期的影響流式結(jié)果顯示,Nocodazole作用HCC1806后以凋亡為特點；MDA-MB-231細胞在接觸該類藥物6h開始出現(xiàn)G2/M期停滯,24h完全停滯在G2/M期,24h后多倍體形成增多,72h以多倍體為主。
　　 2、Nocodazole對MDA-MB-231和HCC1806細胞凋亡的影響No

8、codazole作用MDA-MB-231和HCC1806細胞6h后,細胞開始變圓,24h后細胞全部變圓,HCC1806細胞隨著接觸藥物時間的延長,細胞體積逐漸變小、變形,胞核皺縮,細胞漂浮,凋亡小體形成等典型的凋亡形態(tài)學變化,這類細胞隨著與藥物接觸時間延長逐漸增多,72h后以凋亡小體形成為主；而MDA-MB-231細胞隨著接觸藥物時間的延長,出現(xiàn)細胞體積增大,細胞核大等典型的多倍體形態(tài)學變化的細胞逐漸增多,72h后以多倍體形成為主。We

9、stenBlot結(jié)果顯示,HCC1806細胞在藥物作用24h出現(xiàn)凋亡標志蛋白caspase9、Caspase3的表達,MDA231未檢測出caspase9、caspase3的表達。
　　 3、MDA-231和HCC1806細胞中Bcl-2/Bax蛋白的表達蛋白質(zhì)印跡法檢測顯示,Bax蛋白在HCC1806細胞中持續(xù)表達,藥物作用36h、48h時表達量明顯增加；Bcl-2在HCC1806細胞中亦有表達,24h后表達增加,bcl-2/