白藜蘆醇對人皮膚鱗狀細胞癌ARHI表達和STAT3信號通路活化的雙向調控作用.pdf

1、目的:
　　非黑色素瘤皮膚癌(NMSC)是一類最常見的皮膚癌，據(jù)估算NMSC約占全世界每年確診的所有惡性腫瘤的1/3，患者數(shù)量龐大，嚴重危害公眾健康。最常見的NMSC是皮膚基底細胞癌(Basal Cell Carcinoma，BCC)和鱗狀細胞癌(SquamousCell Carcinoma，SCC)。在我國，皮膚SCC的發(fā)病率比例要比BCC高。通常皮膚SCC可以通過手術和/或放射治療，但是具有一定的復發(fā)可能性，甚至導致淋巴管浸潤

2、以及遠隔轉移。對于老年人、存在手術危險因素和相對年輕病灶位于美容敏感區(qū)域的患者，需要一個理想的化療藥物的替代方案，發(fā)掘有效的生物制劑具有現(xiàn)實的腫瘤治療意義。
　　白藜蘆醇(Resveratrol，Res)是一種天然多酚類化合物，存在于一些植物和草藥中，如葡萄，花生和虎杖等，具有抗氧化、心臟保護以及預防和抑制腫瘤的作用。白藜蘆醇與腫瘤生成的細胞信號通路如p53、STAT3、ERK1/2等密切相關，由此提示，白藜蘆醇極有可能成為皮膚癌

3、臨床治療中的理想候選藥物，但在皮膚鱗狀細胞癌中，其具體作用的信號通路和調控機制鮮見報道，因此，開展白藜蘆醇對皮膚鱗狀細胞癌的研究十分重要。
　　ARHⅠ基因(aplysia ras homologⅠ)是一個母系印記抑癌基因，在多種癌癥中抑制癌細胞的生長，增殖和侵襲，并促進癌細胞的凋亡。ARHⅠ參與多條信號通路的相關調控，其中之一是調控信號轉導和轉錄激活子3(STAT3)信號通路，防止磷酸化的STAT3核易位到細胞核中誘導基因表達，

4、抑制細胞增殖和遷移。有研究發(fā)現(xiàn)在皮膚SCC中磷酸化STAT3的表達比正常皮膚多，磷酸化STAT3的過度表達可能在表皮腫瘤的發(fā)展中起重要作用，而ARHⅠ在皮膚SCC的表達情況鮮見報道。因此綜上所述，探究在皮膚鱗狀細胞癌中ARHⅠ的表達情況，白藜蘆醇、ARHⅠ和STAT3信號通路三者在皮膚鱗狀細胞癌的聯(lián)系，為皮膚鱗狀細胞癌發(fā)病機制的研究，及白藜蘆醇治療皮膚鱗狀細胞癌的策略選擇提供新的理論依據(jù)。
　　方法:
　　84例皮膚癌及74

5、例正常癌旁組織的標本由大連皮膚病醫(yī)院提供，實驗所用的皮膚鱗狀細胞癌細胞系Colo16、SCC-1、SCC-12、SCC-13來自于大連市皮膚病醫(yī)院劉之力教授的饋贈。人永生化角質細胞系HaCat由德國遺傳學研究所MartinHofman博士提供。本實驗通過石蠟組織微陣列技術以及免疫組織化學染色分析ARHⅠ在正常皮膚組織與皮膚癌組織的表達差異。采用MTT分析和流式細胞儀技術觀察各細胞系對白藜蘆醇敏感性的差異。通過RT-PCR、Western

6、印跡雜交和免疫細胞化學染色分析，檢測白藜蘆醇處理前后各細胞系中ARHⅠ、STAT3信號通路的mRNA表達水平和蛋白表達水平的變化。利用免疫熒光染色，觀察白藜蘆醇處理前后ARHⅠ與STAT3在各細胞系中的定位表達情況。
　　結果:
　　1.ARHⅠ在皮膚鱗狀細胞癌組織中顯著低表達于正常皮膚組織，統(tǒng)計學分析P＜0.05。
　　2.各細胞系對白藜蘆醇敏感性的研究
　　2.1 MTT分析結果表明白藜蘆醇抑制各細胞系的細胞

7、增殖。
　　2.2 流式細胞儀檢測結果表明白藜蘆醇處理之后細胞系Colo16、SCC-1和SCC-13發(fā)生G1期阻滯。
　　3.RT-PCR方法檢測分析。在白藜蘆醇處理之后，ARHⅠ在各細胞系中的mRNA表達均有所升高，但STAT3的mRNA表達無明顯變化，我們檢測了一些STAT3信號轉導通路的下游靶基因mRNA的表達情況，結果表明，survivin在細胞系Colo16、 SCC-1、SCC-12和SCC-13中均發(fā)生了mR

8、NA表達下調，其他細胞系無明顯變化;VEGF在細胞系HaCaT、SCC-12和SCC-13中mRNA表達下調，其他細胞系無明顯變化;c-Myc只有在Colo16細胞系中發(fā)生mRNA表達下調，其他細胞系無明顯變化;cyclinD1在各細胞系中mRNA表達均無明顯變化。
　　4.Western印跡雜交分析和免疫細胞化學染色分析。結果表明，在白藜蘆醇處理之后，在各個細胞系中ARHⅠ的蛋白表達均有所升高，STAT3的蛋白表達均無明顯變化，

9、survivin在細胞系SCC-12和SCC-13中蛋白的表達下降，其他細胞系無明顯變化;VEGF在各細胞系中蛋白的表達都下降，其他細胞系無明顯變化;c-Myc在細胞系HaCaT中發(fā)生蛋白的表達下降，其他細胞系無明顯變化，cyclinD1在細胞系HaCaT、Colo16和SCC-13中蛋白的表達下降，其他細胞系無明顯變化。
　　5.細胞免疫熒光技術分析。結果表明在白藜蘆醇作用之后，ARHⅠ與STAT3在核周圍明顯聚集，可能抑制ST

10、AT3的入核。
　　結論:
　　1.抑癌基因ARHⅠ在正常鱗狀上皮組織中是高表達的，在皮膚鱗狀細胞癌組織中是低表達的。
　　2.白藜蘆醇可有效的抑制皮膚鱗狀細胞癌細胞系Colo16、SCC-1、SCC-12、SCC-13的細胞增殖，使細胞發(fā)生G1期阻滯。
　　3.白藜蘆醇可促進人類永生化表皮細胞系HaCaT和皮膚鱗狀細胞癌細胞系Colo16、SCC-1、SCC-12、SCC-13的抑癌基因ARHⅠ的表達，降低ST