金葡菌腸毒素A基因及其突變體表達產(chǎn)物生物學活性研究.pdf

1、背景和目的： 葡萄球菌腸毒素A(staphylococcal enterotoxins A,SEA)是金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的腸毒素之一,為SEA基因編碼的257個氨基酸組成的多肽.SEA是一種細菌超抗原,在極低劑量時即可直接與抗原提呈細胞(antigen presenting cell,APC)MHC Ⅱ類分子和T細胞抗原識別受體(T cell receptor,TCR) Vβ片段高親和力地結合,誘導T淋巴,.母細胞有絲分裂并促進

2、T細胞釋放IL-1β、IL-2和TNF-γ等多種細胞因子,從而發(fā)揮抗腫瘤作用.因此,SEA具有被開發(fā)成升白細胞、抗腫瘤類藥物的前景.然而,SEA具有腸毒性,可引起嘔吐、腹瀉,并導致小鼠死亡.眾所周知,多肽或蛋白類毒素的毒性主要取決于分子中的活性基團,利用定位突變技術改變SEA分子中毒性相關活性基團的氨基酸組成,極有可能獲得低或無毒性、保持促淋巴細胞增殖和抗腫瘤活性的SEA突變體. 本研究中,我們擴增并克隆了不含信號肽序列的全長S

3、EA基因,根據(jù)SEA分子中腸毒性相關位點Protein Data Bank預測結果并參考文獻,采用引物突變法構建了多個目的定位突變體及其原核表達系統(tǒng),并根據(jù)突變前后目的重組蛋白細胞毒性、促淋巴細胞增殖和抗腫瘤細胞活性變化對突變體進行了篩選,以期為進一步研發(fā)安全有效SEA突變體藥物奠定基礎. 實驗方法: 采用高保真PCR和T-A克隆法,從金黃色葡萄球菌ATCCl3565株DNA中擴增并克隆了不含信號肽序列的SEA基因.采用

4、突變引物PCR構建SEA基因定位突變體.建立SEA基因及其定位突變體原核表達系統(tǒng).Ni-NTA親和層析法提純表達的目的重組蛋白,SDS-PAGE鑒定,并對純化的重組蛋白進行透析復性和濾過除菌.采用'FCIDso法測定目的重組蛋白對Vero細胞的細胞毒性.采用MTT比色法分別檢測不同濃度的目的重組蛋白促小鼠脾細胞增殖及對抑制KB及HL-60癌細胞株生長的作用. 結果： 所克隆的SEA基因核苷酸序列與報道序列的相似性為100

5、﹪,7種突變體均在既定位置獲得預期的密碼子突變.rSEA和各突變體重組蛋白表達量約為細菌總蛋白的52﹪.rSEA對Vero細胞TCID<,50>為4.1 μg,其突變體重組蛋白分別為5.8～23.5μg.1和5 μg/ml的rSEA及其5種突變體重組蛋白rSEA/I-1187A、rSEA/tt225A、rSEA/D227A、rSEA/H187A/D227A和rSEA/H225A/D227A對小鼠脾細胞均有明顯的促增殖作用(P<0.05)

6、,10和20 μg/ml的rSEA及上述5種突變體重組蛋白促小鼠脾細胞增殖活性與100 μG/ml PHA相似(P>0.05).5～20 μg/ml的rSEA及上述5種突變體重組蛋白作用的小鼠脾細胞上清及其上清與脾細胞混合物均能有效地抑制KB和HL-60細胞生長(P<0.05). 結論： 本研究成功地構建了SEA基因突變體及其高效原核表達系統(tǒng),其表達產(chǎn)物的細胞毒性均有所降低.由于rSEA/H225A、rSEA/D227A