RNAi沉默F(xiàn)AK表達(dá)對Hep-2細(xì)胞株增殖及侵襲能力影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、頭頸部鱗形細(xì)胞癌(Head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC)是人類常見的惡性腫瘤之一，其中喉癌占7.9％-35％。過去幾十年里，盡管診療技術(shù)不斷提高，喉癌的生存率仍然沒有明顯提高，這與腫瘤細(xì)胞的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是致死性進(jìn)程的主要原因之一，也是腫瘤預(yù)后主要指標(biāo)和指導(dǎo)治療的重要依據(jù)。許多學(xué)者致力于研究腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的分子學(xué)依據(jù)，期待能發(fā)現(xiàn)更精確更可靠的生物學(xué)標(biāo)志。癌細(xì)胞對細(xì)胞外基

2、質(zhì)的黏附性降低是腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲、轉(zhuǎn)移的重要原因之一。粘著斑激酶(focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)是一個(gè)多功能的非受體酪氨酸激酶，它在細(xì)胞間及細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)粘附中起關(guān)鍵作用。有學(xué)者研究證明，F(xiàn)AK與乳腺癌、直腸癌、甲狀腺癌、肝癌、前列腺癌的侵襲及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，而在頭頸部腫瘤的研究甚少。本課題以頭頸部常見惡性腫瘤喉癌為研究對象，利用免疫組化研究喉癌組織及細(xì)胞株中FAK的表達(dá)，再進(jìn)一步研究利用RAN干擾(RNA in

3、terference)沉默F(xiàn)AK表達(dá)對喉癌Hep-2細(xì)胞株生物學(xué)行為的影響。實(shí)驗(yàn)共分兩部分： 第一部分、FAK在喉癌組織及細(xì)胞株中的表達(dá)。 目的：本部分以喉癌組織及Hep-2細(xì)胞株為研究對象，采用免疫組化SP法及細(xì)胞免疫方法分別檢測FAK在喉癌組織及細(xì)胞株中的表達(dá)，并研究其表達(dá)與患者臨床病理特征之間的關(guān)系。 方法： (1)隨機(jī)抽取42例喉癌患者組織病理標(biāo)本，以同期聲帶息肉組織標(biāo)本作為對照。采用免疫組織化學(xué)

4、法檢測喉癌組織中FAK的表達(dá)，并結(jié)合患者的臨床病理資料對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 (2)常規(guī)培養(yǎng)喉癌Hep-2細(xì)胞株，采用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測Hep-2細(xì)胞株中的FAK表達(dá)。 結(jié)果： (1)喉癌組織中FAK的表達(dá)：喉癌組織中FAK的陽性表達(dá)率78.57％(33/42)，對照組(聲帶息肉)中陽性率12.50％(5/40)(P＜0.05)；喉癌組織中FAK的表達(dá)與臨床分期、頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，

5、與病理學(xué)分級及臨床分型比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。 (2)喉癌Hep-2細(xì)胞株中FAK的表達(dá)為陽性。 結(jié)論：喉癌組織中FAK表達(dá)與腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移能力相關(guān)；喉癌Hep-2細(xì)胞株中FAK表達(dá)為陽性。 第二部分、RNAi沉默F(xiàn)AK表達(dá)對Hep-2細(xì)胞株增殖及侵襲能力的影響。 目的：構(gòu)建在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)FAK的重組質(zhì)粒FAK-pGenesil，并作用于Hep-2細(xì)胞株。探討重組質(zhì)粒對Hep-2細(xì)胞株

6、FAK mRNA及蛋白的抑制作用，以及對Hep-2細(xì)胞株的增殖、侵襲能力的影響。 方法：根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫提供的FAK基因核苷酸序列(基因號GI：439874；ACCES2SION：L13616)設(shè)計(jì)的兩條多聚核苷酸序列，構(gòu)建兩條干擾重組質(zhì)粒FAK-pGenesil-CH1和FAK-pGenesil-CH2，并設(shè)計(jì)一條陰性對照重組質(zhì)粒FAK-pGenesil-HK；在脂質(zhì)體的介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染喉癌Hep-2細(xì)胞株，優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件提高

7、轉(zhuǎn)染效率；用RT-PCR和 Western Blot分析FAK mRNA及蛋白的表達(dá)；MTT法、流式細(xì)胞儀及體外侵襲實(shí)驗(yàn)，測定干擾重組質(zhì)粒對Hep-2細(xì)胞株的的增殖、侵襲能力的影響。 結(jié)果： (1)細(xì)胞轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化及細(xì)胞轉(zhuǎn)染率的觀察：當(dāng)所構(gòu)建重組質(zhì)粒與脂質(zhì)體的質(zhì)量體積比為1:2.5轉(zhuǎn)染時(shí)，轉(zhuǎn)染效率最高達(dá)55％。 (2)RT-PCR及Westem blot的結(jié)果：干擾重組質(zhì)粒FAKpGenesil-CH1、FAK

8、-pGenesil-CH2能使Hep-2細(xì)胞株中FAK mRNA及FAK蛋白的表達(dá)下調(diào)。FAK mRNA抑制率分別為71.54％、67.89％，與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；FAK蛋白抑制率達(dá)分別為41.74％、39.38％，與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。 (3)MTT法、流式細(xì)胞儀及體外侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果： MTT顯示干擾重組質(zhì)粒FAK-pGenesil-CH1、FAK-pGenesil-CH2作用于

9、Hep-2細(xì)胞株48小時(shí)后，細(xì)胞增殖抑制率分別為58.34％、52.78％，對照組為8.34％(P＜0.05)：流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞周期顯示，干擾重組質(zhì)粒FAK-pGenesil-CH1、FAK-pGenesil-CH2作用于Hep-2細(xì)胞株48小時(shí)后細(xì)胞增殖率為25.28％、25.67％，與對照組和正常組比較，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；體外侵襲實(shí)驗(yàn)示，F(xiàn)AK-pGenesil-CH1、FAK-pGenesil-CH2作用Hep-