外周血造血干細胞凍存保護劑的研究.pdf

1、背景
　　 造血干細胞移植(hematopoietic stem cell transplantation,HSCT)是目前治療多種惡性/難治性血液病、實體瘤、免疫缺陷病和嚴重放射病的有效方法。此外,造血干細胞在組織工程、再生醫(yī)學、基因治療等領域的研究和應用方興未艾。為滿足研究和應用的需求,深低溫條件下長期保存造血干細胞是非常必要的。有效的保護劑及其合適的濃度與最佳升降溫速率相結合,才能做到對造血干細胞的深低溫長期保存,并保持其

2、活力和其他生物學特性。有效的凍存保護劑是保持造血干細胞低溫保存復蘇后活力的一個基本條件。
　　 長期以來,國內外科學家對外周血造血干細胞(peripheral blood stem cells,PBSC)的低溫保護劑進行研究,不斷改進保護劑的組合和種類。海藻糖是一種穩(wěn)定的非還原性雙糖,廣泛存在于海藻、酵母、霉菌、食用菌等生物體內,無毒副作用,在體內可被酶水解成為葡萄糖而利用。海藻糖化學性質十分穩(wěn)定,除了具有低聚糖的一般特性,還具

3、有抗高溫、抗寒及穩(wěn)定細胞膜等作用,在高溫、高寒、高滲透壓及干燥失水等惡劣環(huán)境下,能夠在細胞表面能形成獨特的保護膜,從而對生命體和生物大分子起到良好的非特異性保護作用。海藻糖具有保護生物細胞和活性物質在低溫、干燥等不良環(huán)境下活性不受破壞的獨特生物學性質,日益受到人們重視,正在深入研究其對人類細胞冷凍或冰凍干燥保存的保護作用。
　　 納米技術是指在納米尺度(1-100nm)下對物質進行制備、研究和工業(yè)化的一門綜合性的技術。納米材料以

4、其小尺寸和高比表面效應在醫(yī)藥領域得到廣泛應用并具有廣闊的前景。納米技術用于醫(yī)藥領域克服了傳統(tǒng)藥物許多缺陷,并顯示出許多優(yōu)越性:提高藥物溶解度,延長藥物作用時間,增加細胞膜及多種屏障對于藥物的通透性。
　　 目的:
　　 本研究基于海藻糖低溫保護生物細胞和活性物質的作用,初步探索以海藻糖為基礎的安全有效的PBSC凍存保護劑的可行性,探討幾種因素對凍存復蘇后PBSC的存活率、活力及增殖能力的影響,如:海藻糖濃度、負載溫度、負

5、載時間、海藻糖的物理性狀等,篩選出海藻糖導入PBSC的最適濃度、溫度和時間。比較患者自身和健康供者的PBSC在相同條件下凍存效果的差異。主要目的是探索新型的凍存保護劑配方,預防含有DMSO的凍存保護劑保存的PBSC凍存復蘇后輸入人體產生的不良反應,避免DMSO對PBSC的潛在毒性。
　　 方法:
　　 1.用不同濃度海藻糖負載PBSC,通過臺盼藍拒染法檢測復蘇后細胞存活率、顯微鏡下觀察負載后細胞形態(tài)的改變、流式細胞術測定

6、CD34+細胞的百分數(shù)及甲基纖維素培養(yǎng)體系觀察細胞增殖能力等,評價海藻糖負載PBSC的可行性。
　　 2.在不同負載溫度(4℃,22℃,37℃)下用海藻糖負載PBSC不同時間(1h,2h,3h),通過測定復蘇后細胞存活率、CD34+細胞回收率和細胞增殖能力等,篩選出海藻糖負載PBSC的最佳條件。
　　 3.改進海藻糖的物理性狀,將海藻糖納米化處理,通過檢測復蘇后細胞存活率、細胞增殖能力等指標,評價判斷納米化海藻糖是否有助

7、于提高海藻糖對PBSC低溫保護作用。
　　 4.比較海藻糖負載患者自身和健康供者PBSC凍存復蘇后的細胞存活率及細胞增殖能力的差別。
　　 統(tǒng)計學分析應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理,數(shù)據(jù)以(x)±s表示,各組間的差異應用One-way ANOVA檢驗方法進行比較,方差齊性時,組間多重比較采用LSD法,方差不齊時,采用Dunnett T3檢驗；P<0.05時表示差異有顯著意義。
　　 結果:
　　

8、 1.海藻糖深低溫保存PBSC的可行性
　　 凍存復蘇后細胞存活率:海藻糖濃度為0.5mol/L、1.0mol/L負載PBSC凍存復蘇后細胞存活率分別為(45.93±7.25)％和(33.20±7.78)％,未添加海藻糖的PBSC凍存復蘇后細胞存活率為(4.00±2.29)％,三者之間的差異均有統(tǒng)計學意義(P=0.000<0.001,P=0.000<0.001,P=0.000<0.001)。CFU-GM回收率:未添加海藻糖的PB

9、SC凍存復蘇后由于細胞存活率過低,無法進行集落培養(yǎng),CFU-GM回收率計為0,海藻糖濃度為0.5mol/L、1.0mol/L負載PBSC凍存復蘇后CFU-GM回收率分別為(84.66±4.65)％和(73.56±9.56)％,海藻糖濃度為0.5mol/L、1.0mol/L負載PBSC分別與未添加海藻糖的PBSC凍存復蘇后CFU-GM回收率進行統(tǒng)計學比較,有顯著差異(P=0.000<0.001,P=0.000<0.001)。以0.5mol

10、/L濃度的海藻糖與以1.0mol/L濃度的海藻糖負載PBSC凍存復蘇后,CFU-GM回收率統(tǒng)計學比較顯示:前者明顯高于后者,差異有統(tǒng)計學意義(P=0.001)。CD34+細胞回收率:0.5mol/L、1.0mol/L濃度海藻糖負載PBSC分別與未添加海藻糖的PBSC凍存復蘇后比較,差異有統(tǒng)計學意義(P值均=0.000<0.001)。濃度為0.5mol/L與1.0mol/L海藻糖負載PBSC凍存復蘇后比較,無統(tǒng)計學差異(P=0.081)。

11、由此可見海藻糖深低溫保存PBSC可行,0.5 mol/L是最佳的海藻糖負載濃度。
　　 2.海藻糖深低溫保存PBSC的最佳負載條件研究
　　 用濃度為0.5 mol/L的海藻糖溶液負載PBSC分別在4℃、22℃、37℃負載3小時。結果顯示,細胞存活率:4℃與22℃條件下孵育的PBSC凍存復蘇后細胞存活率之間存在顯著差異(P=0.049),4℃、22℃條件下孵育的PBSC分別與37℃條件下孵育的PBSC凍存復蘇后細胞存活率

12、進行比較,存在顯著差異(P=0.000)；CD34+細胞回收率:4℃、37℃條件下孵育的PBSC分別與22℃條件下孵育的PBSC凍存復蘇后CD34+細胞回收率進行統(tǒng)計學比較,無顯著差異(P>0.05),4℃與37℃條件下孵育的PBSC凍存復蘇后CD34+細胞回收率之間有顯著差異(P<0.05),后者顯著高于前者；CFU-GM回收率:4℃、37℃條件下孵育的PBSC分別與22℃條件下孵育的PBSC凍存復蘇后CFU-GM回收率進行統(tǒng)計學比較

13、,無顯著差異(P>0.05),4℃與37℃條件下孵育的PBSC凍存復蘇后CFU-GM回收率之間比較,前者低于后者,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。因此37℃是海藻糖負載PBSC的最佳負載溫度。
　　 最佳負載時間的研究中,用濃度為0.5 mol/L的海藻糖溶液負載PBSC在37℃條件下負載1、2、3h。三個負載時間點的細胞存活率和CD34+細胞回收率均無顯著差異(P>0.05):負載1h與2h、1h與3h的PBSC凍存復蘇后C

14、FU-GM回收率之間均有顯著差異(P<0.05),負載1h的PBSC凍存復蘇后CFU-GM回收率為(90.13±2.60)％,顯著高于負載2h和3h。負載2h與3h的PBSC凍存復蘇后CFU-GM回收率之間無顯著差異(P>0.05)。因此,綜合考慮各因素,1小時是海藻糖負載PBSC的最佳負載時間。
　　 3.納米化海藻糖深低溫保存PBSC的效果
　　 多重比較結果顯示:0.5mol/L納米化海藻糖、1.0mol/L納米化

15、海藻與0.5mol/L普通海藻糖負載PBSC凍存復蘇后細胞存活率進行統(tǒng)計學比較,差異有顯著意義(P<0.05),0.5mol/L納米化海藻糖與1.0mol/L納米化海藻負載PBSC凍存復蘇后細胞存活率之間無顯著差異(P>0.05)；0.5mol/L普通海藻糖與0.5mol/L納米化海藻糖、1.0mol/L納米化海藻負載PBSC凍存復蘇后CFU-GM回收率之間均無顯著差異(P>0.05)。故納米化海藻糖有助于提高海藻糖對PBSC的低溫保護

16、作用,但是對于PBSC的增殖能力沒有提高。
　　 4.海藻糖深低溫保存患者與健康供者PBSC的效果
　　 來源患者的PBSC與健康供者的PBSC凍存復蘇后細胞存活率、CFU-GM回收率及CD34+細胞回收率比較,差異均有統(tǒng)計學意義(P=0.000<0.001,P=0.009,P=0.030),健康供者的PBSC凍存復蘇后細胞存活率、CFU-GM回收率及CD34+細胞回收率顯著高于患者的PBSC。
　　 結論:

17、r>　　 海藻糖對于深低溫保存PBSC有一定的保護作用,用海藻糖作為PBSC的低溫保護劑是可行的。海藻糖負載PBSC的最適宜濃度為0.5mol/L；37℃,1小時是海藻糖負載PBSC的最佳條件。海藻糖負載PBSC凍存復蘇后細胞存活率可達58％,復蘇后的PBSC形態(tài)和集落生長方式都與凍前的生長形態(tài)相同。雖然海藻糖具有對人體無毒副作用的優(yōu)勢,但是與DMSO相比,海藻糖的保護效果仍較低,尚未達到臨床應用的理想效果。海藻糖為非滲透性保護劑,研