仁術健胃顆粒對慢性萎縮性胃炎的實驗研究.pdf

1、仁術健胃顆粒在臨床上廣泛用于慢性萎縮性胃炎(ChronicAtrophicGastritis，CAG)的治療，治療效果很好。為了探討仁術健胃顆粒治療慢性萎縮性胃炎的作用機制，以便更好的服務臨床治療，為仁術健胃顆粒治療CAG獲得更滿意的效果。依據(jù)臨床上仁術健胃顆粒治療CAG脾氣虛證患者效果更優(yōu)，本課題進行實驗研究，建立CAG脾氣虛證大鼠模型，給予仁術健胃顆粒治療CAG脾氣虛證大鼠模型，觀察仁術健胃顆粒對CAG脾氣虛證的藥效學作用。為了進一

2、步探討仁術健胃顆粒的治療CAG癌前病變，培養(yǎng)胃癌細胞，研究仁術健胃顆粒兔含藥血清對N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍（N-Methyl-N-nitroso-N’-nitroguanidine，MNNG）致人胚胃粘膜上皮細胞惡性轉(zhuǎn)化細胞即MC的增殖、凋亡以及P16、Fas、Survivin表達的影響。
　　 第一部分使用MNNG和酒精，配合饑飽失常、破氣苦降、疲勞耗氣的多因素方法建立CAG脾氣虛證大鼠模型，觀察多因素造模方法對CA

3、G脾氣虛證大鼠體重、體溫，脾臟指數(shù)，胃指數(shù)和胃部組織病理的影響，評價CAG脾氣虛證大鼠模型。結果：CAG脾氣虛證大鼠模型體重明顯低于正常組，存在顯著性差異(p＜0.01);CAG脾氣虛證大鼠模型體重增長率也明顯低于正常組，存在顯著性差異(p＜0.01)。CAG脾氣虛證大鼠模型脾臟重量低于正常組，存在顯著性差異(p＜0.01);CAG脾氣虛證大鼠模型胃指數(shù)高于正常組，存在顯著性差異(p＜0.01)。多因素造模的方法會使大鼠體溫產(chǎn)生較大波動

4、。
　　 CAG脾氣虛證大鼠模型胃部組織的病理改變?nèi)缦袤w數(shù)量，炎細胞浸潤，腺體腸化，粘膜糜爛，及潰瘍形成等的積分數(shù)高于正常組，存在顯著性差異(p＜0.01)。提示：MNNG和酒精，配合饑飽失常、破氣苦降、疲勞耗氣的方法建立CAG脾氣虛證大鼠模型，會造成大鼠機體多方面的改變和損傷，其中以胃部組織的病理改變，最能客觀表現(xiàn)CAG脾氣虛證大鼠模型的成功建立。
　　 第二部分給予CAG脾氣虛證大鼠模型仁術健胃顆粒進行治療，觀察大鼠

5、胃粘膜破壞因子如內(nèi)皮素(ET)，一氧化氮合酶(NOS)，胃動素(MTL)的變化，胃粘膜保護因子如胃泌素(GAS)，生長抑素(SS)，分泌型免疫球蛋白(SIgA)的變化，以及胃部環(huán)氧合酶2(COX-2)，基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)和表皮生長因子受體(EGFR)的表達，探討仁術健胃顆粒對如上因子的影響。
　　 結果：(1)CAG脾氣虛證模型組的ET、NOS、MTL水平高于正常組，存在顯著性差異(p＜0.05);仁術健胃顆粒12g

6、/kg劑量組的ET水平低于CAG脾氣虛證模型組，存在顯著性差異(p＜0.05)；仁術健胃顆粒6g/kg和3g/kg劑量組的NOS的水平低于CAG脾氣虛證模型組，存在顯著性差異(p＜0.05)；仁術健胃顆粒12g/kg和6g/kg劑量組的MTL的水平低于CAG脾氣虛證模型組，存在顯著性差異(p＜0.05)。提示：仁術健胃顆粒的治療，可以降低CAG脾氣虛證模型異常升高的胃粘膜破壞因子ET、NOS、MTL水平，使其接近或恢復正常水平。

7、　　 (2)CAG脾氣虛證大鼠模型GAS，SS和SIgA水平比正常組低，存在顯著性差異(p＜0.05)。仁術健胃顆粒12g/kg，6g/kg,3g/kg劑量組的GAS水平均比CAG脾氣虛模型組高，存在顯著性差異(p＜0.05)。仁術健胃顆粒僅12g/kg劑量組SS水平比CAG脾氣虛模型組高，存在顯著性差異(p＜0.05)。仁術健胃顆粒6g/kg,3g/kg劑量組的SIgA水平比CAG脾氣虛模型組高，存在顯著性差異(p＜0.05)。提示

8、：仁術健胃顆粒的治療，能提高CAG脾氣虛證模型異常降低的胃粘膜保護因子GAS、SS、SIgA水平，使其接近或恢復正常水平。
　　 (3)CAG脾氣虛證大鼠模型的COX-2、MMP-2、EGFR表達均處于較高水平。仁術健胃顆粒12g/kg，6g/kg,3g/kg劑量組均可以降低COX-2、MMP-2、EGFR的表達，與CAG脾氣虛證大鼠模型組比較，存在顯著性差異(p＜0.05)。提示：仁術健胃顆粒的治療，可以降低CAG脾氣虛證模型

9、胃部組織COX-2、MMP-2和EGFR的表達。
　　 第三部分培養(yǎng)人胚胃粘膜上皮細胞惡性轉(zhuǎn)化的細胞即MC，探討仁術健胃顆粒兔含藥血清的對MC的增殖和P16的表達影響，以及對MC的凋亡和Fas、survivin表達的影響。結果：仁術健胃顆粒高、中、低劑量組和維甲酸組MC的增殖數(shù)量低于生理鹽水組，存在顯著性差異(P＜0.05)；仁術健胃顆粒高、中、低劑量組和維甲酸組MC的P16蛋白表達高于生理鹽水組，存在顯著性差異(P＜0.05)

10、。
　　 仁術健胃顆粒高、中、低劑量組和維甲酸組-MC的凋亡率高于生理鹽水組，存在顯著性差異(P＜0.05)；仁術健胃顆粒高、中、低劑量組和維甲酸組MC的Fas蛋白表達高于生理鹽水組，存在顯著性差異(P＜0.05)；仁術健胃顆粒高、中、低劑量組和維甲酸組MC的Survivin蛋白表達高于生理鹽水組，存在顯著性差異(P＜0.05)。提示：仁術健胃顆粒含藥血清可以抑制MC增殖，提高MC的凋亡，提高MC中P16的表達，提高Fas表達，

11、降低Survivin表達。
　　 結論：通過對大鼠胃組織的病理學檢查，可以判斷使用多因素法可以成功建立CAG脾氣虛證大鼠模型。
　　 仁術健胃顆?？梢哉{(diào)節(jié)CAG脾氣虛證模型異常變化的胃粘膜破壞因子ET、NOS、MTL和胃粘膜護因子GAS、SS、SIgA接近或恢復到正常水平，減少COX-2、MMP-2、EGFR的表達，起到治療和預防CAG的作用。
　　 仁術健胃顆粒可以抑制胃癌細胞的增殖，促進胃癌細胞的凋亡，其機制

12、與提高胃癌細胞P16的表達，提高胃癌細胞Fas的表達，降低胃癌細胞Survivin有緊密聯(lián)系。
　　 第一部分，慢性萎縮性胃炎脾氣虛證大鼠模型的建立
　　 目的：觀察多因素法建立CAG脾氣虛證大鼠模型，觀察CAG脾氣虛證大鼠體重的變化，脾臟和胃指數(shù)的變化，胃部組織病理形態(tài)學的改變。方法：采用N—甲基—N—硝基—N—亞硝基胍(MNNG)和40％乙醇灌胃建立大鼠慢性萎縮性胃炎(CAG)模型，同時采用破氣苦降，饑飽失常和疲勞的

13、方法進一步建立CAG脾氣虛證大鼠模型。觀察CAG脾氣虛證大鼠不同時期病理形態(tài)學的改變。以170μg/mL的MNNG10mL/kg灌胃，150μg/mL的MNNG溶液給大鼠自由飲用,40%乙醇，2mL/只，每周2次，在此基礎上第5周采用破氣苦降，饑飽失常和疲勞的方法建立CAG脾氣虛證大鼠模型，連續(xù)10周。每2周隨機處死CAG脾氣虛證大鼠2只，取胃部組織進行光鏡觀察。連續(xù)觀察CAG脾氣虛證大鼠模型的體重，實驗末觀察胃組織重量指數(shù)，脾重量指數(shù)

14、，制作胃組織病理切片進行形態(tài)學觀察。結果：CAG脾氣虛證模型組大鼠體重低于正常組，存在顯著性差異(p＜0.01);CAG脾氣虛證模型組脾臟重量低于正常組脾臟重量存在顯著性差異(p＜0.01)，CAG脾氣虛大鼠胃指數(shù)高于正常組胃指數(shù)存在顯著性差異(p＜0.01)，CAG脾氣虛證模型的胃組織炎細胞浸潤，粘膜糜爛，及潰瘍數(shù)量和程度明顯高于正常組。結論：多因素法建立CAG脾氣虛證大鼠模型，會造成胃部嚴重的炎癥，使胃粘膜糜爛，進而發(fā)生粘膜萎縮和腸

15、化生，會影響大鼠體重的增加和臟器的正常功能。
　　 第二部分，仁術健胃顆粒對慢性萎縮性胃炎脾氣虛證大鼠的影響
　　 第一節(jié)，仁術健胃顆粒對體重和胃組織病理形態(tài)的影響
　　 目的：觀察仁術健胃顆粒對CAG脾氣虛證大鼠體重，胃和脾臟器指數(shù)，胃組織病理形態(tài)的影響。方法：復制CAG脾氣虛證大鼠模型，隨機分為相應各組，給予仁術健胃顆粒以及胃復春進行治療，連續(xù)觀察大鼠的體重和體溫的變化，實驗末對胃組織進行病理學觀察。結果：C

16、AG脾氣虛證模型組大鼠體重低于正常組，存在顯著性差異(p＜0.01)仁術健胃顆粒治療各組可以增加大鼠體重與模型組比較，存在顯著性差異(p＜0.01)。結論：MNNG和酒精影響大鼠的生長，會使體重增加緩慢，體溫波動大，仁術健胃顆粒能改善CAG脾氣虛證大鼠的生長，增加體重，減小體溫波動。
　　 第二節(jié)，仁術健胃顆粒對胃粘膜破壞因子ET、NOS和MTL的影響
　　 目的：通過觀察仁術健胃顆粒對慢性萎縮性胃炎脾氣虛證大鼠內(nèi)皮素(

17、ET)，一氧化氮合酶(NOS)和胃動素(MTL)的影響，探討仁術健胃顆粒預防和治療慢性萎縮性胃炎的機制。方法：大鼠（除正常組）采用自由飲用MNNG溶液，灌胃40%的酒精，饑飽失常，疲勞運動相結合的方法復制CAG脾氣虛證模型。實驗末檢測CAG脾氣虛證模型組大鼠血清中的ET，NOS和MTL的水平。結果：CAG脾氣虛證模型組大鼠ET，NOS和MTL水平高于正常組，存在顯著性差異(p＜0.05)；仁術健胃顆粒12g/kg劑量組的ET水平低于CA

18、G脾氣虛證模型組，存在顯著性差異(p＜0.05)；仁術健胃顆粒6g/kg和3g/kg劑量組的NOS的水平低于CAG脾氣虛證模型組，存在顯著性差異(p＜0.05)；仁術健胃顆粒12g/kg和6g/kg劑量組的MTL的水平低于CAG脾氣虛證模型組，存在顯著性差異(p＜0.05)。結論：CAG脾氣虛證通過仁術健胃顆粒治的治療，可以降低異常升高的胃粘膜破壞因子ET、NOS和MTL水平，使其接近或回復正常水平。
　　 第三節(jié)，仁術健胃顆粒

19、對胃粘膜保護因子GAS、SS和SIgA的影響
　　 目的：通過觀察仁術健胃顆粒對慢性萎縮性胃炎(CAG)脾氣虛證大鼠胃泌素(GAS)，生長抑素(SS)和分泌型免疫球蛋白(SIgA)的影響，探討仁術健胃顆粒預防和治療慢性萎縮性胃炎的機制。方法：大鼠（除正常組）采用自由飲用MNNG溶液，灌胃40%的酒精，破氣苦降，饑飽失常，疲勞運動相結合的方法復制CAG脾氣虛證證模型。然后將CAG脾氣虛證證模型大鼠隨機分為相應各組。實驗末檢測各組大

20、鼠的GAS，SS和SIgA的水平。結果：CAG脾氣虛證大鼠模型GAS，SS和SIgA水平比正常組低，存在顯著性差異(p＜0.05)。仁術健胃顆粒12g/kg，6g/kg,3g/kg劑量組的GAS水平均比CAG脾氣虛模型組高，存在顯著性差異(p＜0.05)。仁術健胃顆粒12g/kg劑量組SS水平比CAG脾氣虛模型組高，存在顯著性差異(p＜0.05)。仁術健胃顆粒6g/kg,3g/kg劑量組的SIgA水平比CAG脾氣虛模型組高，存在顯著性差

21、異(p＜0.05)。結論：仁術健胃顆粒能夠提高胃粘膜保護因子GAS，SS和SIgA水平，起到保護胃粘膜防止胃炎的惡化作用。
　　 第四節(jié)，仁術健胃顆粒對胃組織COX-2、MMP-2和EGFR的影響
　　 目的：通過觀察仁術健胃顆粒對慢性萎縮性胃炎(CAG)脾氣虛證大鼠COX-2，MMP-2，EGFR的影響，探討仁術健胃顆粒預防和治療慢性萎縮性胃炎的機制。方法：大鼠（除正常組）采用自由飲用MNNG溶液，灌胃40%的酒精，破

22、氣苦降，饑飽失常，疲勞運動相結合的方法復制CAG脾氣虛證模型。然后將CAG脾氣虛證模型大鼠隨機分為相應各組。實驗末檢測各組大鼠的COX-2，MMPs-2，EGFR的表達。結果：CAG脾氣虛證大鼠模型組的COX-2，MMPs-2，EGFR表達均處于較高水平。CAG脾氣虛證大鼠模型組COX-2在腺體細胞胞漿中表達明顯，整個粘膜都呈現(xiàn)深棕黃色，為棕黃色顆粒，主要表達于細胞質(zhì)；CAG脾氣虛證大鼠模型組MMP-2在粘膜中表達明顯，整個粘膜都呈現(xiàn)深

23、棕黃色；CAG脾氣虛證大鼠模型組EGFR表達明顯，從基底部到粘膜表層，范圍廣，呈現(xiàn)深棕色。仁術健胃顆粒12g/kg，6g/kg,3g/kg劑量組均可以降低COX-2，MMPs-2，EGFR的表達，與CAG脾氣虛證大鼠模型組存在顯著性差異(p＜0.05)。結論：仁術健胃顆?？梢越档臀覆拷M織COX-2、MMPs-2和EGFR的表達，起到預防癌變的作用。
　　 第三部分，仁術健胃顆粒對MC的影響
　　 第一節(jié)，仁術健胃顆粒對M

24、C的增殖和P16表達的影響
　　 目的：觀察仁術健胃顆粒兔含藥血清對MC的增殖和P16表達的影響。方法：使用仁術健胃顆粒兔含藥血清，培養(yǎng)MC，采用MTT法檢測細胞增殖情況，運用免疫組化法檢測細胞P16表達的情況。結果：仁術健胃顆粒高、中、低劑量組和維甲酸組MC的增殖數(shù)量低于生理鹽水組，存在顯著性差異(P＜0.05)。仁術健胃顆粒高、中、低劑量組和維甲酸組均能顯著提高MC的P16蛋白表達，與生理鹽水組比較存在顯著性差異(P＜0.0

25、5)。結論：仁術健胃顆粒兔含藥血清能明顯抑制MC的增殖數(shù)量，提高MC的P16表達水平。
　　 第二節(jié)，仁術健胃顆粒對MC的凋亡與Fas、Survivin的影響
　　 目的：觀察仁術健胃顆粒兔含藥血清對MC的凋亡和Fas、Survivin蛋白表達的影響。方法：使流式細胞術AnnexinV-FITC/PI雙標法檢測MC的凋亡，運用免疫組化法檢測Fas、Survivin蛋白表達。結果：仁術健胃顆粒高、中、低劑量組和維甲酸組MC