快速檢測(cè)雙歧桿菌的ELISA試劑盒的研制.pdf

1、近年來(lái)，隨著免疫學(xué)的不斷發(fā)展以及血清學(xué)技術(shù)的應(yīng)用，對(duì)雙歧桿菌的鑒定和檢測(cè)已從傳統(tǒng)的平板計(jì)數(shù)方法發(fā)展到應(yīng)用以抗原抗體反應(yīng)為基礎(chǔ)的各種酶免疫檢測(cè)方法。在所有以抗原抗體反應(yīng)為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法中，酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay,ELISA)是目前發(fā)展最為迅速并且較為完善的檢測(cè)方法。ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記，根據(jù)酶反應(yīng)底物顯色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。由于利用了酶的高效

2、率催化反應(yīng)，間接放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使測(cè)定具有極高的靈敏度。而且，ELISA檢測(cè)是在微量板中進(jìn)行的，可以對(duì)大量樣品同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，節(jié)省了時(shí)間。ELISA法中的雙抗體夾心方法是常用來(lái)檢測(cè)抗原的方法。目前所報(bào)道的相關(guān)研究中，都未能對(duì)利用雙抗夾心ELISA方法檢測(cè)雙歧桿菌的反應(yīng)條件進(jìn)行建立并且沒(méi)有對(duì)雙歧桿菌進(jìn)行定量檢測(cè)的研究。ELISA方法克服了傳統(tǒng)平板計(jì)數(shù)法的繁瑣及分子生物學(xué)檢測(cè)方法的費(fèi)用昂貴等缺點(diǎn)，如能開(kāi)發(fā)出其檢測(cè)雙歧桿菌的試劑盒將對(duì)實(shí)際

3、應(yīng)用將具有重要意義。故此，建立本課題展開(kāi)這方面的研究。 本課題中，自制并獲得了高效價(jià)免疫血清；建立并優(yōu)化了雙抗夾心ELISA檢測(cè)雙歧桿菌的方法；用建立起的ELISA法組裝試劑盒，對(duì)試劑盒進(jìn)行方法學(xué)評(píng)價(jià)，非雙歧桿菌屬微生物對(duì)本試劑盒的檢測(cè)結(jié)果無(wú)影響，重復(fù)性良好，對(duì)雙歧桿菌的最低檢出限為106cfu/mL(g)；檢測(cè)時(shí)間為4h；用此試劑盒檢測(cè)市售酸奶(1)、市售乳粉和自制乳粉(2)進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，與傳統(tǒng)菌落計(jì)數(shù)方法相比，兩種檢測(cè)方法檢測(cè)

4、結(jié)果差異不顯著(p＞0.05)；用此試劑盒對(duì)自制含雙歧桿菌的乳粉產(chǎn)品(1)進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，與傳統(tǒng)菌落計(jì)數(shù)方法相比，兩種檢測(cè)方法檢測(cè)結(jié)果差異顯著(p＜0.05)。具體研究結(jié)果如下： 1.免疫血清的制備制備出的兔抗長(zhǎng)雙歧桿菌免疫血清效價(jià)可達(dá)1:20480；鼠抗長(zhǎng)雙歧桿菌免疫血清效價(jià)達(dá)1:10240，均具有較高的效價(jià)。 2.雙抗夾心ELISA方法檢測(cè)雙歧桿菌最適反應(yīng)條件的建立. 通過(guò)對(duì)雙抗夾心ELISA檢測(cè)方法中各反應(yīng)條件

5、進(jìn)行摸索和比較，確定最佳反應(yīng)條件為：最佳包被抗體和二抗反應(yīng)濃度分別為1:160和1:5120.選用NBS和1％BSA-PBS分別作為包被緩沖液和封閉緩沖液；封閉30min：酶標(biāo)抗體作1:2000的稀釋之后作用90min；最后底物反應(yīng)時(shí)間為20min；并且繪制了此方法檢測(cè)雙歧桿菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出了標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=0.4461x-2.1503，相關(guān)系數(shù)為R2=0.9881。 3.ELISA試劑盒的組裝試劑盒主要組分有：兔抗長(zhǎng)雙歧桿

6、菌免疫血清包被并封閉的8×12孔酶標(biāo)板；工作濃度鼠抗長(zhǎng)雙歧桿菌免疫血清；工作濃度酶標(biāo)抗體；長(zhǎng)雙歧桿菌標(biāo)準(zhǔn)品：底物溶液；終止液：濃縮洗滌液；操作方法及說(shuō)明。 4.試劑盒的方法學(xué)評(píng)價(jià)對(duì)所組建的雙抗夾心ELISA檢測(cè)雙歧桿菌的試劑盒進(jìn)行了方法學(xué)評(píng)價(jià)，包括：特異性、重復(fù)性、靈敏度。對(duì)分別含有4種不同雙歧桿菌和七種不含雙歧桿菌的樣品進(jìn)行檢測(cè)，非雙歧桿菌屬微生物對(duì)檢測(cè)結(jié)果沒(méi)有影響，說(shuō)明此方法具有較強(qiáng)的特異性；用五種不同樣品對(duì)板間及板內(nèi)分別做

7、了重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，僅有很好的幾分樣品變異系數(shù)超過(guò)10％，說(shuō)明此試劑盒具有良好的重復(fù)性；對(duì)雙歧桿菌的最低檢出限為10％cfu/mL; 5.試劑盒的保存期實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)包被酶標(biāo)板的保質(zhì)期進(jìn)行測(cè)定，實(shí)驗(yàn)證明，此試劑盒能在4℃的條件下保存一年以上； 6.試劑盒在雙歧桿菌檢測(cè)中的應(yīng)用采用所組建的雙歧桿菌雙抗夾心ELISA試劑盒對(duì)市售雙歧桿菌的酸奶、奶粉及自制雙歧桿菌乳粉進(jìn)行檢測(cè)與平板計(jì)數(shù)法相比。用此試劑盒檢測(cè)市售酸奶(1)、市售乳粉和自制