漢族白癜風(fēng)患者HLA-A-0201限制性CTL表位的篩查與鑒定.pdf

1、白癜風(fēng)是由表皮局部功能性黑素細(xì)胞進(jìn)行性破壞、脫失所致,全球平均發(fā)病率為0.5％-2%。白癜風(fēng)的黑素細(xì)胞損傷可由多種因素共同作用所致,其中氧化應(yīng)激損傷及自身免疫機(jī)制是黑素細(xì)胞破壞的主要原因。細(xì)胞內(nèi)外的活性氧簇(ROS)的蓄積及清除障礙可引起氧化應(yīng)激,直接引起黑素細(xì)胞損傷乃至凋亡。而自身免疫機(jī)制,尤其是細(xì)胞免疫在黑素細(xì)胞的破壞中起著至關(guān)重要的作用。對(duì)皮損局部以及外周循環(huán)中的T細(xì)胞進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)其可以特異性地識(shí)別黑素細(xì)胞相關(guān)抗原,并可殺傷同種

2、HLA分型的黑素細(xì)胞,提示細(xì)胞免疫機(jī)制在白癜風(fēng)黑素細(xì)胞損傷中發(fā)揮重要作用?？乖R(shí)別作為整個(gè)細(xì)胞免疫反應(yīng)的起始環(huán)節(jié)發(fā)揮著關(guān)鍵作用。作為白癜風(fēng)患者中常見的HLA分型,HLA-A*0201限制性的T細(xì)胞抗原表位的鑒定是白癜風(fēng)的細(xì)胞免疫機(jī)制研究一項(xiàng)重要基礎(chǔ)性工作。上世紀(jì)90年代以來,國(guó)外通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及
　　cDNA-iCOS方法明確了黑素瘤中HLA-A*0201限制性的T淋巴細(xì)胞特異性識(shí)別的黑素瘤表達(dá)的抗原。黑素細(xì)胞分化抗原主要集中在以下

3、蛋白中:酪氨酸酶(tyrosinase)、gp100以及MART-1。黑素瘤患者注射特異性識(shí)別以上黑素瘤抗原表位的T淋巴細(xì)胞可以殺傷黑素瘤細(xì)胞,一定程度上緩解黑素瘤患者的病情。研究發(fā)現(xiàn),白癜風(fēng)患者外周血單個(gè)核細(xì)胞也可特異性地識(shí)別上述黑素瘤抗原表位,活化外周血T淋巴細(xì)胞,產(chǎn)生IFN-γ等細(xì)胞因子。證實(shí)這些抗原表位可能是白癜風(fēng)發(fā)病中的自身抗原,為進(jìn)一步研究白癜風(fēng)的自身免疫機(jī)制提供了線索。
　　我們課題組前期的研究發(fā)現(xiàn):白癜風(fēng)患者的黑素

4、細(xì)胞抗氧化應(yīng)激能力異常、易于凋亡;白癜風(fēng)患者體內(nèi)抗氧化酶如谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶、過氧化氫酶、甲硫氨酸硫氧化物還原酶等存在基因突變,引起其功能異常;白癜風(fēng)患者黑素細(xì)胞中Nrf2/ARE抗氧化應(yīng)激通路功能缺陷致使其易發(fā)生ROS損傷。多種因素共同作用導(dǎo)致黑素細(xì)胞抗氧化能力降低,ROS產(chǎn)生增多。ROS引起黑素細(xì)胞功能和結(jié)構(gòu)異常,胞內(nèi)蛋白轉(zhuǎn)位至細(xì)胞外膜,并被氧化修飾,容易被免疫細(xì)胞識(shí)別吞噬。氧化應(yīng)激狀態(tài)下黑素細(xì)胞誘導(dǎo)黑素細(xì)胞膜表面鈣網(wǎng)蛋白(CRT)和內(nèi)

5、質(zhì)網(wǎng)蛋白57(Erp57)聚集,可增強(qiáng)黑素細(xì)胞的免疫原性,活化抗原提呈細(xì)胞。白癜風(fēng)自身抗原如tyrosinase、MART-1、gp100等在氧化應(yīng)激狀態(tài)下發(fā)生膜外暴露、氨基酸修飾,導(dǎo)致其免疫原性改變,引起自身免疫細(xì)胞對(duì)其的識(shí)別、引發(fā)下游自身免疫反應(yīng)。
　　基于本課題組的研究基礎(chǔ),綜合國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn),我們提出了系統(tǒng)的白癜風(fēng)發(fā)病機(jī)制假說:在遺傳背景基礎(chǔ)上,白癜風(fēng)患者黑素細(xì)胞抗氧化能力降低,氧化應(yīng)激引起黑素細(xì)胞抗原暴露并誘導(dǎo)特異性自身免疫

6、應(yīng)答,破壞黑素細(xì)胞并形成“瀑布式效應(yīng)”。氧化應(yīng)激損傷在黑素細(xì)胞破壞中為始動(dòng)因素,自身免疫應(yīng)答損毀黑素細(xì)胞則是白癜風(fēng)急速發(fā)展的重要原因。因此,本項(xiàng)目擬在前期研究基礎(chǔ)上,篩選黑素細(xì)胞自身抗原特異性T細(xì)胞表位、構(gòu)建致病抗原/HLA-A*0201四聚體,明確白癜風(fēng)自身免疫發(fā)病機(jī)制中的自身抗原,闡明自身抗原特異性CTL殺傷黑素細(xì)胞的關(guān)鍵啟動(dòng)機(jī)制。通過明確氧化應(yīng)激打破免疫耐受后啟動(dòng)自身免疫應(yīng)答的細(xì)胞和分子機(jī)制,有望闡明上述發(fā)病機(jī)制假說中有待證明的關(guān)

7、鍵環(huán)節(jié),對(duì)系統(tǒng)認(rèn)識(shí)白癜風(fēng)臨床現(xiàn)象及明確防治策略將產(chǎn)生重大影響。
　　方法:
　　1.閱讀文獻(xiàn),明確白癜風(fēng)中HLA-A*0201限制性抗原表位:tyrosinase369-377,3D:YMDGTMSQV、gp100209-217,2M:IMDQVPFSV、gp100280-288,9V:YLEPGPVTV、MART-126-35,2L: ELAGIGILTV、MART-126-35:EAAGIGILTV,合成上述表位肽段后,

8、選取進(jìn)展期HLA-A*0201白癜風(fēng)患者并分離其外周血單個(gè)核細(xì)胞,利用ELISPOT技術(shù)明確患者淋巴細(xì)胞針對(duì)特異性抗原肽段的免疫反應(yīng)。并將治療前后的ELISPOT實(shí)驗(yàn)結(jié)果相比較,明確免疫反應(yīng)水平與疾病進(jìn)展有無關(guān)聯(lián)。
　　2.利用軟件,預(yù)測(cè)出tyrosinase、gp100、MART-1中可能的HLA-A*0201限制性抗原表位。篩選進(jìn)展期HLA-A*0201白癜風(fēng)患者,將分離的外周血單個(gè)核細(xì)胞與抗原肽段共同孵育,利用ELISPOT

9、技術(shù)確定淋巴細(xì)胞可特異性識(shí)別的抗原肽段。將篩選出的肽段進(jìn)行T2細(xì)胞結(jié)合力實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞因子檢測(cè)、四聚體流式以及激光共聚焦實(shí)驗(yàn)等功能學(xué)驗(yàn)證。
　　結(jié)果:
　　1.48位進(jìn)展期HLA-A*0201白癜風(fēng)患者針對(duì)上述5條白癜風(fēng)相關(guān)肽段的特異性T細(xì)胞頻率分別為4.63/2×105 PBMC、7.44/2×105 PBMC、13.42/2×105 PBMC、5.60/2×105 PBMC、4.71/2×105 PBMC。其中37位患者治療

10、1月后,對(duì)gp100280-288,9V(YLEPGPVTV)肽段的細(xì)胞免疫水平顯著下降。
　　2.綜合軟件BIMAS、SYFPEITHI的預(yù)測(cè)結(jié)果,在tyrosinase中篩選出可能的抗原肽段51條,gp100中可能的抗原肽段106條,MART-1中可能的抗原肽段13條。每10條左右肽段組成一個(gè)肽池,用肽池分別刺激進(jìn)展期HLA-A*0201白癜風(fēng)患者外周血單個(gè)核細(xì)胞。篩選出的陽性肽池有:tyrosinase(3號(hào)、5號(hào)),gp1

11、00(12號(hào)、13號(hào)),MART-1(無)。
　　3.用3個(gè)陽性肽池中的肽段逐一刺激白癜風(fēng)患者外周血單個(gè)核細(xì)胞,利用ELISPOT實(shí)驗(yàn)最終確定陽性肽段有:①Gp100 P-112 QILKGGSGT;②tyrosinase P-41 AMVGAVLTA;③Gp100 P-118 QLIMPGQEA;④tyrosinase P-24 SSADVEFCL;⑤tyrosinase P-28 TLEGFASPL;⑥Gp100 P-119

12、TLEGFASPL。
　　4.ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)陽性肽段刺激患者外周血單個(gè)核細(xì)胞后產(chǎn)生的胞外細(xì)胞因子,證實(shí)P-112肽段刺激患者外周血單個(gè)核細(xì)胞產(chǎn)生高水平IFN-γ,其余陽性肽段刺激后未見顯著升高的細(xì)胞因子。親和力實(shí)驗(yàn)、四聚體的流式及激光共聚焦實(shí)驗(yàn)均未見陽性反應(yīng)。
　　結(jié)論:
　　1.漢族白癜風(fēng)患者淋巴細(xì)胞對(duì)黑素細(xì)胞自身抗原表位存在特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答,這種應(yīng)答水平與疾病活動(dòng)性相關(guān)。
　　2.在漢族HLA-A*02