TRB3基因參與高糖誘導的胰島β細胞凋亡機制的研究.pdf

1、β細胞功能衰竭是2型糖尿病晚期一個重要的特征，高糖誘導的細胞凋亡是導致胰島β細胞功能衰竭的主要原因之一。研究高糖誘導的胰島β細胞凋亡的分子機制對闡明2型糖尿病的發(fā)生和發(fā)展，以及對糖尿病的防治都具有重要的意義。 Tribbles同源蛋白3(tribbleshomolog3，TRB3)是新發(fā)現(xiàn)的一種具有廣泛生物學功能的基因。TRB3可以和AKT/PKB(proteinkinsaseB)結合抑制胰島素信號通路，參與胰島素抵抗的發(fā)生；通

2、過ATF4/CHOP(activatingtranscriptionfactor4/CCAAT/enhancerbindingproteinshomologusprotein)通路參與細胞應激反應的調控。目前TRB3基因是否參與高糖誘導的胰島β細胞凋亡的研究尚未見文獻報道。 目的： 研究高糖條件下TRB3基因的表達情況，以及TRB3基因過表達對高糖誘導的胰島β細胞凋亡的影響和可能涉及的分子機制。 方法：

3、應用實時定量PCR(real-timequantitativepolymerasechainreaction，real-timePCR)檢測糖尿病GK大鼠(Goto-KakizakiWistarrat，GKrat)胰島細胞和高糖刺激的INS-1細胞中TRB3基因mRNA的表達。應用Tet-on系統(tǒng)將TRB3質粒轉染到INS-rβ(r9)細胞內，構建可誘導TRB3基因表達的β細胞系。采用real-timePCR和細胞免疫熒光方法證實所構建

4、的β細胞TRB3基因的可誘導性。應用免疫蛋白印記(WesternBlot)分析強力土霉素(doxycycline，DOX)誘導β細胞TRB3基因表達的量-效和時-效關系。應用酶聯(lián)免疫吸附分析(enzymelinkedimmuneosorbentassay，EILSA)和MTT法分別檢測TRB3基因過表達對β細胞胰島素分泌和細胞增殖的影響。應用DNA片段化、TUNEL、AnnexinV/PI流式細胞儀分析高糖條件下TRB3過表達對β細胞凋

5、亡的影響，以及RNA干擾TRB3基因表達對β細胞凋亡的調節(jié)作用。應用激光共聚焦顯微鏡觀察TRB3基因過表達的β細胞線粒體形態(tài)和細胞色素C分布。應用WesternBlot和ELISA分別檢測細胞色素C含量和capase-3活性。應用流式細胞術檢測TRB3基因過表達對β細胞線粒體膜電位(membranepotential，△ψm)和反應性活性氧(reactiveoxygenspecies，ROS)產生的影響。 結果： 糖尿病

6、GK大鼠胰島細胞中TRB3mRNA的表達較正常對照組明顯升高，高糖可以明顯上調INS-1細胞中TRB3基因mRNA的表達。采用Tet-on系統(tǒng)，我們建立了TRB3基因可誘導的β細胞系。DOX可以誘導TRB3基因在此細胞系中的表達，并表現(xiàn)明顯的量-效和時-效關系。在高糖條件下，TRB3基因過表達可以抑制β細胞的增殖并減少胰島素的分泌。采用DNA片段法，TUNEL染色和流式細胞分析都證實，TRB3基因過表達明顯促進高糖引起的β細胞凋亡。采用

7、siRNA干擾技術抑制TRB3基因在β細胞內的表達，則可明顯降低高糖誘導的β細胞凋亡。激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，TRB3基因過表達的β細胞的線粒體形態(tài)發(fā)生變化，細胞色素C的分布出現(xiàn)異常。WesternBlot顯示細胞色素C釋放增加。ELISA檢測發(fā)現(xiàn)，TRB3過表達的β細胞中Caspase-3的活性升高。流式細胞儀分析顯示，TRB3過表達促進β細胞線粒體△ψm下降和ROS含量增加。以上結果提示，這些因素可能與TRB3基因參與高糖誘導胰島