GLP-1及其類似物對高糖環(huán)境下人臍靜脈內(nèi)皮細胞功能的保護作用及可能機制.pdf

1、目的：本課題擬探討高糖誘導內(nèi)皮細胞功能紊亂的機制，在進行高糖培養(yǎng)前用胰高血糖素樣肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）及其受體激動劑Exendin-4預處理，觀察其對高糖培養(yǎng)的原代人臍靜脈內(nèi)皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）內(nèi)皮功能紊亂的影響，并進一步探討其與氧化應激、磷脂酰肌醇3-激酶/Akt（phosphatidyl inositol-3

2、-kinase/Akt，PI3K/Akt）信號通路、乙二醛酶-1（glyoxalase–1，GLO-1）及糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end-products，AGES）等的關(guān)系。
　　方法：（1）從健康孕婦剖宮產(chǎn)新生兒臍靜脈中分離原代HUVECs，培養(yǎng)于含內(nèi)皮細胞生長添加劑（endothelial cell growth supplement，ECGS）的M199培養(yǎng)基中，取生長狀態(tài)良好的第3-5代細胞

3、用于后續(xù)實驗。實驗分組：正常對照組（C組），不做任何處理；高糖處理組（HG組），30mMD-葡萄糖培養(yǎng)；GLP-1干預組（G+HG組），按HG組條件處理前按需加入GLP-1100nM預處理1 h；Exendin-4干預組（El+HG組及E2+HG組），按HG組條件處理前分別按需加入Exendin-4100nM或200nM干預1h。
　?。?）檢測細胞上清中漏出的乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）酶活性

4、，進行細胞毒性作用定量分析。
　?。?）一氧化氮（nitric oxide，NO）熒光探針檢測細胞內(nèi)NO產(chǎn)量，Real Time PCR檢測一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）mRNA表達水平，Western Blot檢測eNOS蛋白表達水平，體現(xiàn)內(nèi)皮細胞功能狀態(tài)。
　?。?）檢測細胞內(nèi)活性氧族（reactive oxygen species，ROS）水平、超氧化物歧化

5、酶（superoxide dismutase，SOD）活力反映細胞內(nèi)氧化應激狀態(tài)，化學發(fā)光法檢測細胞內(nèi)ROS，黃嘌呤氧化酶法檢測SOD活力。
　　（5）利用細胞凋亡檢測技術(shù)DAPI染核、FITC-PI雙染流式細胞術(shù)、Western Blot檢測Cleaved Caspase-3蛋白表達觀察細胞凋亡情況。
　?。?）Real Time PCR檢測GLO-1mRNA表達水平，Western Blot檢測GLO-1蛋白表達水平，酶

6、聯(lián)免疫吸附試驗ELISA法檢測細胞上清及細胞內(nèi) GLO-1、AGES、糖基化終末產(chǎn)物受體（advanced glycation end-products receptor，RAGE）的含量。
　?。?）探討GLP-1及Exendin-4對高糖下HUVECs功能的保護作用可能機制，Western Blo t檢測p-Akt/Akt蛋白表達率的變化，反映細胞內(nèi)PI3K/Akt信號通路的激活情況。
　　結(jié)果：實驗結(jié)果顯示，30mM高

7、糖可誘導HUVECs細胞凋亡加速、NO生物利用下降，共同促成內(nèi)皮細胞功能紊亂；高糖培養(yǎng)還可導致細胞內(nèi)氧化應激狀態(tài)、刺激AGES生成、下調(diào)GLO-1，進一步介導內(nèi)皮損傷。GLP-1及Exendin-4對高糖環(huán)境下的HUVECs功能具有保護作用，具體表現(xiàn)如下：
　?。?）GLP-1及Exendin-4改善高糖環(huán)境對細胞的毒性作用，LDH法測得單獨高糖處理組（HG組）LDH漏出量為對照組的181.07％±3.35%，G+HG組、E1+H

8、G組及E2+HG組的LDH漏出量分別為對照組的134.94%±1.78%、136.56%±2.18%、134.74%±1.56%，P均小于0.01。
　?。?）GLP-1及Exendin-4促進高糖環(huán)境下細胞內(nèi)NO生成。HG組細胞內(nèi)NO熒光強度、細胞內(nèi)eNOS mRNA及蛋白表達均降低；G+HG、E1+HG、E2+HG等組細胞內(nèi)NO熒光強度較HG組升高約1倍（39.33±2.49、40.31±2.22、39.90±2.22 vs1

9、9.21±1.10，P＜0.01），細胞內(nèi)eNOS mRNA（104.01%±4.72%、101.95%±5.35%、105.16%±5.95%vs48.16%±2.54%，P＜0.01）、蛋白表達（0.71±0.01、0.72±0.01、0.72±0.02 vs0.56±0.01，P＜0.01）均上調(diào)。
　?。?）GLP-1及Exe nd in-4可改善高糖環(huán)境下細胞內(nèi)氧化應激狀態(tài)。30 mM D-葡萄糖處理7天HUVECs細胞

10、內(nèi)ROS熒光強度增強一倍以上（300.00±4.73 vs137.58±7.37，P＜0.01）；G+HG、E1+HG和E2+HG等組細胞內(nèi)ROS熒光強度分別為156.68±9.40、158.14±11.05、156.52±9.73，各組ROS產(chǎn)生可抑制至對照組水平（P＜0.01）；SOD活力分別為39.20±2.21 U/mgpro te in、38.17±1.59 U/mgp rote in、39.44±2.65 U/mgpro t

11、e in，SOD活力較HG組提高了65%（P＜0.01）。
　?。?）30mMD-葡萄糖處理引起內(nèi)皮細胞凋亡加速，GLP-1及Exendin-4干預使細胞凋亡形態(tài)明顯改善，DAPI染核計數(shù)凋亡細胞數(shù)減少，流式細胞術(shù)測得細胞凋亡率降低（28.28±2.06%、28.64±1.83%、28.60±1.86%vs39.13±1.53%，P＜0.01），同時Cleaved Caspase-3蛋白表達下調(diào)（0.33±0.02、0.32±0.

12、02、0.32±0.02 vs0.3842±0.01155，P＜0.01）。
　?。?）GLP-1及Exendin-4可能具有調(diào)節(jié)與糖基化作用相關(guān)的GLO-1和AGES的作用。HG組細胞內(nèi)GLO-1蛋白表達下調(diào)，細胞膜RAGE受體表達上調(diào)，細胞上清中AGES釋放增加；G+HG、E1+HG、E2+HG等組細胞內(nèi)GLO-1表達較HG組上調(diào)（ELISA法：2.34±0.17ng/mgprotein、2.35±0.17ng/mgprote

13、in、2.31±0.16ng/mgprotein vs1.51±0.11ng/mgproteinein，P＜0.01），GLO-1 mRNA表達也增加，而細胞上清中AGES產(chǎn)生減少（1472±142.2ng/ml、1515±103.6 ng/ml、1426±124.4ng/ml vs2042±121.9ng/ml P＜0.01）。
　　（6）GLP-1及Exendin-4對高糖環(huán)境下HUVECs功能的保護可能與激活了PI3K-AK