藍莓花青素中錦葵色素對TNF-α誘導的內(nèi)皮細胞炎癥反應損傷的保護作用研究.pdf

1、研究背景：
　　心血管疾病是危害人類健康的頭號殺手，而80-90％心血管疾病患者都伴隨著高血壓?！白柚垢哐獕猴嬍秤媱?DASH)”中重要的一條就是增加水果蔬菜的攝入量。細胞因子腫瘤壞死因子-α(TNF-α)作為重要的炎癥因子，可以誘導內(nèi)皮細胞表達相應蛋白，能顯著增強血管內(nèi)皮細胞單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)、細胞間粘附分子-1(ICAM-1)和血管細胞間粘附分子-1(VCAM-1)蛋白和mRNA的表達，促進炎癥發(fā)生及發(fā)展進程。

2、藍莓作為功能性食品，其果實中花青素的含量很高，具有抗炎癥、增強心臟功能、改善血管循環(huán)、防止腦神經(jīng)衰老、明目及抗癌等獨特功效。研究發(fā)現(xiàn)藍莓花青素中錦葵色素的含量很高，因此本文以氯化錦葵色素、氯化錦葵色素-3-葡萄糖苷及氯化錦葵色素-3-半乳糖苷為研究對象，研究它們對TNF-α誘導的體外人臍靜脈內(nèi)皮細胞炎癥的保護作用及糖苷協(xié)同作用，并從分子基礎上研究其作用機制，為心血管疾病的研究提供一定的理論基礎。
　　研究目的:
　　1. 體

3、外分離人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)，采用TNF-α干預細胞，建立內(nèi)皮細胞功能損傷所致的炎癥模型，觀察不同濃度氯化錦葵色素、氯化錦葵色素-3-葡萄糖苷及氯化錦葵色素-3-半乳糖苷對內(nèi)皮細胞的保護作用。
　　2. 采用ELISA、Western Blot及RT-PCR方法檢測不同錦葵色素對細胞中MCP-1、ICAM-1及VCAM-1的表達情況，探討它們保護HUVEC的分子機制。
　　3. 觀察細胞中及細胞核中IκBα蛋白表達情

4、況及NF-κB核轉(zhuǎn)錄情況，從分子基礎上解釋不同氯化錦葵色素對HUVEC炎癥的保護作用及糖苷協(xié)同作用。
　　研究方法:
　　1. 采用酶解法體外分離新鮮的嬰兒臍帶，得到人臍靜脈內(nèi)皮細胞，用M199完全培養(yǎng)基進行培養(yǎng)、傳代及凍存;取3-6代人臍靜脈內(nèi)皮細胞進行試驗。
　　2. 采用不同濃度的腫瘤壞死因子TNF-α誘導HUVEC4 h及采用最佳濃度的TNF-α刺激細胞不同時間，取其細胞，分別采用ELISA檢測細胞上清中MCP

5、-1、ICAM-1及VCAM-1蛋白表達水平;采用Western Blot檢測細胞中ICAM-1及VCAM-1蛋白表達水平，根據(jù)分析結(jié)果確定TNF-α誘導HUVEC最佳劑量及時效。
　　3. 采用不同濃度的氯化錦葵色素、氯化錦葵色素-3-葡萄糖苷及氯化錦葵色素-3-半乳糖及選擇最佳濃度的糖苷預處理細胞18h，加入10μg/L TNF-α刺激6h，分別采用MTT法檢測細胞活力;采用ELISA檢測細胞上清中MCP-1及VCAM-1蛋白

6、表達水平;采用Western Blot檢測細胞中ICAM-1及VCAM-1蛋白表達水平，采用熒光定量RT-PCR檢測細胞MCP-1及VCAM-1 mRNA的表達水平。
　　4. 采用最佳濃度的錦葵色素糖苷作用細胞，采用Western Blot檢測細胞中IκBα蛋白表達變化，采用核轉(zhuǎn)錄-轉(zhuǎn)運試劑盒檢測細胞質(zhì)中NF-κB核轉(zhuǎn)錄情況，從分子基礎上研究抗炎癥作用的機制。
　　研究結(jié)果:
　　1. TNF-α誘導HUVEC表達M

7、CP-1、ICAM-1及VCAM-1蛋白
　　正常細胞少量表達MCP-1、ICAM-1及VCAM-1蛋白，在受到炎癥因子TNF-α刺激時，各蛋白的表達量上升。不同濃度TNF-α刺激HUVEC得到細胞上清及細胞，通過ELISA及Western Blot檢測MCP-1、ICAM-1及VCAM-1蛋白呈濃度依賴性變化，低濃度時蛋白表達量不顯著，隨著濃度增加，蛋白表達量增加，具有顯著性，尤其在濃度為10μg/L時，相比對照組MCP-1、I

8、CAM-1及VCAM-1蛋白表達具有顯著性意義(P＜0.01)。
　　采用最佳濃度10μg/L TNF-α刺激細胞不同時間，表達量呈時間依賴性變化;短刺激時間對細胞中MCP-1、ICAM-1及VCAM-1蛋白表達量影響較小，隨著刺激時間的增加，表達量亦增長，尤其在刺激時間6h，細胞上清中可溶性MCP-1、ICAM-1及VCAM-1蛋白表達量達到峰值，分別是對照組的3.762±0.041、8.436±0.367、8.554±0.06

9、9倍，具有顯著性差異(P＜0.01)。細胞中ICAM-1/β-Actin及VCAM-1/β-Actin相對表達分別為對照組的2.268±0.012(P＜0.001)、1.616±0.022(P＜0.01)倍;在刺激時間為6h時，兩者蛋白表達量達到峰值。
　　2. 氯化錦葵色素抑制TNF-α誘導的HUVEC中MCP-1、ICAM-1及VCAM-1蛋白的表達
　　MTT法檢測細胞活力顯示:當1、10、50、100μmol/L M

10、v-Cl、Mv-3-glc-Cl及Mv-3-gal-Cl相比空白組的抑制率為92.6％、87.6％、70.1％、64.8％，92.6％、87.6％、70.1％、64.8％及86.3％、85.1％、70.3％、61.5％，與TNF-α共同作用時，相比TNF-α刺激組具有顯著性意義(P＜0.01)，說明Mv-Cl、Mv-3-glc-Cl及Mv-3-gal-Cl不同程度的對內(nèi)皮細胞具有一定的保護作用，由于濃度的增加，對細胞活力具有一定的影響。

11、
　　采用ELISA、Western Blot及RT-RCR檢測細胞中MCP-1、ICAM-1及VCAM-1蛋白及mRNA表達情況，正常情況下，正常細胞少量表達MCP-1、ICAM-1及 VCAM-1蛋白及mRNA，當細胞受到炎癥因子TNF-α刺激時，三種因子的表達量上升，當不同濃度Mv-Cl(1、10、50、100μmol/L)作用細胞時，蛋白及mRNA的表達量相比TNF-α刺激組具有顯著下降，尤其是濃度為50、100μmol/

12、L時，三種因子的抑制率達到90％以上，接近于正常組，說明隨著濃度的增加，Mv-Cl對TNF-α誘導的內(nèi)皮細胞炎癥具有保護作用.
　　3. 氯化錦葵色素-3-O-葡萄糖苷及半乳糖苷抑制TNF-α誘導的HUVEC中MCP-1、ICAM-1及VCAM-1蛋白的表達
　　通過ELISA、Western Blot及RT-PCR方法檢測細胞中MCP-1、ICAM-1及VCAM-1蛋白及mRNA變化，得出:不同濃度的Mv-3-glc-Cl

13、、Mv-3-gal-Cl對TNF-α引起的炎癥反應呈濃度依賴式保護作用。對于細胞中MCP-1及VCAM-1蛋白或mRNA，Mv-3-glc-Cl比Mv-3-gal-Cl抑制效果更明顯，但在低濃度刺激時，對于細胞中ICAM-1，Mv-3-gal-Cl比Mv-3-glc-Cl作用效果明顯，但隨著濃度增加，葡萄糖苷式作用比半乳糖苷式發(fā)揮更強的保護作用。
　　4. 糖苷氯化錦葵色素協(xié)同抑制TNF-α誘導的HUVEC中MCP-1、ICAM-

14、1及VCAM-1蛋白的表達及分子機理研究
　　通過ELISA法及Werstern Blot及RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)預處理的Mv-3-glc-Cl、Mv-3-gal-Cl和(Mv-3-glc-Cl+Mv-3-gal-Cl)對MCP-1、 ICAM-1和VCAM-1蛋白及mRNA表達相比單獨刺激TNF-α組具有明顯的抑制作用，并且具有協(xié)同作用。通過Western Blot檢測細胞質(zhì)中IκBα蛋白得出，正常細胞受到TNF-α介導時，IκB

15、α蛋白含量降低，驗證了IκBα被降解，從而表達MCP-1，ICAM-1和VCAM-1;而當孵育不同濃度氯化錦葵色素時，IκBα相對降解量相比TNF-α組減少。此外，通過免疫熒光檢測NF-κ Bp65核轉(zhuǎn)運情況也得到相應結(jié)果，正常細胞NF-κB捕捉的熒光強度很弱。單獨TNF-α組NF-κB捕捉的熒光強度最強，隨著Mv-3-glc-Cl、Mv-3-gal-Cl和(Mv-3-glc-Cl+Mv-3-gal-Cl)的加入，NF-κB熒光強度相對