β-catenin對惡性黑色素瘤細胞A375的增殖、侵襲、遷移及凋亡的影響.pdf

1、背景:
　　惡性黑色素瘤是一種較常見的惡性腫瘤,好發(fā)于皮膚部,惡性程度高,平均生存期約30.3個月,且發(fā)病率呈逐年上升趨勢。目前,治療惡性黑色素瘤主要的手段有手術及抗腫瘤治療(化療、放療、生物治療),但其療效均較差。于是尋求一種新的有效治療措施有著重要意義。近年來,發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin信號通路與多種惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展均有密切聯(lián)系,但其作用機制沒有被完全認知?，F(xiàn)已認為,Wnt/β-catenin信號轉導通路的核心蛋白β-ca

2、tenin在細胞漿內(nèi)異常聚積是Wnt/β-catenin信號轉導通路激活的標志。本實驗利用含有β-catenin特異序列RNA干擾慢病毒沉默β-catenin蛋白的表達,以此阻斷Wnt/β-catenin信號轉導通路,觀察β-catenin沉默對惡性黑色素瘤A375細胞增殖、侵襲、遷移及凋亡的影響。
　　目的:
　　探討通過沉默Wnt/β-catenin信號通路中的關鍵蛋白β-catenin,觀察β-catenin對人惡性黑

3、色素瘤A375細胞增殖、侵襲、遷移以及凋亡的影響,從而為惡性黑色素瘤的治療提供依據(jù)。
　　方法:
　　1.制作干擾慢病毒液:β-catenin-RNAi-LV(β-catenin干擾慢病毒液)和β-catenin-negative-LV(空載體慢病毒液)。分別感染人惡性黑色素瘤A375細胞,得到的穩(wěn)定感染細胞株分別標記為A375-RNAi、A375-negative。采用Western Blot法檢測感染后的A375-RNA

4、i、A375-negative細胞中β-catenin蛋白表達水平,并以未感染的細胞作對照。
　　2. MTT法分別檢測A375-RNAi、A375-negative細胞增殖能力,并以未感染的細胞作對照。
　　3.采用細胞平板克隆形成實驗檢測A375-RNAi、A375-negative細胞平板克隆形成能力,并以未感染的細胞作對照。
　　4.采用Transwell法檢測A375-RNAi、A375-negative細胞

5、體外趨化侵襲、遷移能力,并以未感染的細胞作對照。
　　5.流式細胞術亞G1峰法檢測A375-RNAi、A375-negative細胞的凋亡率,并以未感染的細胞作對照。
　　結果:
　　1. Western Blot結果顯示:β-catenin在人惡性黑色素瘤A375細胞中高表達,β-catenin在A375-RNAi細胞中的表達量下降,A375-RNAi細胞β-catenin蛋白的表達量較未感染的 A375細胞下降約5

6、5.1％( P<0.05),證實β-catenin被β-catenin-RNAi-LV有效沉默;A375-negative細胞內(nèi)β-catenin蛋白表達量與A375細胞無明顯差異(P>0.05)。
　　2. MTT結果顯示:A375-RNAi細胞與A375-negative細胞、A375細胞相比增殖活性均降低(P<0.05);A375-negative細胞較A375細胞增殖活性無明顯差異(P>0.05)。
　　3.細胞平板

7、克隆實驗檢測結果:A375-RNAi細胞與A375-negative細胞、A375細胞平板克隆形成能力相比均減低(P<0.05);A375-negative細胞較A375細胞平板克隆形成能力無明顯差異(P>0.05)。
　　4. Transwell結果顯示:A375-RNAi細胞與A375-negative細胞、A375細胞侵襲、遷移能力相比均顯著下降(P<0.05),A375-negative細胞較A375細胞的侵襲、遷移能力無

8、明顯差異(P>0.05)。
　　5.流式細胞術結果顯示:A375-RNAi細胞與A375-negative細胞、A375細胞相比凋亡率明顯增高(P<0.05);A375-negative細胞較A375細胞凋亡率無顯著差異性(P>0.05)。
　　結論:
　　1.慢病毒載體介導siRNA能有效沉默人黑色素細胞瘤A375細胞內(nèi)β-catenin蛋白的表達。
　　2.下調(diào)β-catenin表達能使人黑色素細胞瘤A375