PAC-1聯(lián)合MCP對結(jié)腸癌細胞的協(xié)同殺傷作用及其分子機制研究.pdf

1、背景：
　　 結(jié)腸癌是一種常見的惡性腫瘤，在我國，近幾年結(jié)腸癌成為發(fā)病率上升最快的癌癥之一。盡管近年來結(jié)腸癌的治療水平有了很大的提高，但是其五年生存率仍徘徊在30-66％之間，沒有明顯提高?；熓墙Y(jié)腸癌治療的一個重要步驟，但化療耐藥及其毒副作用卻限制了其療效的進一步提高。原因之一是這些藥物的作用靶點都是位于凋亡級聯(lián)反應(yīng)的上游或中游，凋亡級聯(lián)系統(tǒng)下游的執(zhí)行蛋白仍有可能受其他信號通路的影響而抵抗細胞凋亡的執(zhí)行。因此尋求一種能特異性誘

2、導(dǎo)腫瘤細胞凋亡且毒副作用小的靶向藥物已成為研究熱點。
　　 分子靶向治療就是針對腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的關(guān)鍵大分子，包括參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的細胞信號傳導(dǎo)和其他生物學(xué)途徑的重要靶點，通過特異性阻斷腫瘤細胞的信號傳導(dǎo)，來控制其基因表達和改變生物學(xué)行為，或是通過阻斷腫瘤血管生成，從而抑制腫瘤細胞的生長和增殖，發(fā)揮抗腫瘤作用。相對于手術(shù)、放療、化療三大傳統(tǒng)治療手段，分子靶向治療具有較好的分子選擇性，能高效并選擇性地殺傷腫瘤細胞，減少

3、對正常組織的損傷。
　　 半胱天冬酶原活化復(fù)合物-1（procaspase-activating compound-1，PAC-1）是美國伊利諾伊大學(xué)P.J.Hergenrother教授領(lǐng)導(dǎo)的研究小組通過篩選25000多種物質(zhì)后發(fā)現(xiàn)的一種小分子復(fù)合物，它能高效活化半胱天冬酶原-3（procaspase-3）轉(zhuǎn)化為半胱天冬酶（caspase-3），而后者是細胞凋亡通路下游的凋亡執(zhí)行關(guān)鍵蛋白，進而誘導(dǎo)多種腫瘤細胞產(chǎn)生凋亡。
　

4、　 低分子柑桔果膠是從天然果膠產(chǎn)物中提取得到的一種以半乳糖為主要成份的多糖，研究發(fā)現(xiàn)低分子柑桔果膠是體內(nèi)半乳糖凝集素-3(Galectin-3)配體的競爭性抑制劑，它與Bcl-2有明顯的序列相似性，在羧基端都含有NWGR基序，而該基序是Bcl-2抑制凋亡所必需的。Bcl-2抑制凋亡的癌基因，作用于內(nèi)源性細胞凋亡信號通路。
　　 雖然既往的研究已經(jīng)證實PAC-1和低分子柑桔果膠可以通過作用于不同的細胞凋亡的關(guān)鍵蛋白或關(guān)鍵途徑發(fā)揮

5、抗腫瘤作用，但兩者聯(lián)合應(yīng)用是否能夠具有更強的促進凋亡、抗腫瘤作用，它們對結(jié)腸癌細胞的作用及其機理如何，目前國內(nèi)外尚未見文獻報道。根據(jù)：caspase-3是凋亡通路下游的執(zhí)行蛋白，Bcl-2通過調(diào)節(jié)內(nèi)源性細胞凋亡通路上游的Cyt-c的釋放來調(diào)控細胞凋亡，我們推測PAC-1聯(lián)合低分子柑桔果膠可以通過直接活化caspase-3誘導(dǎo)細胞凋亡及抑制Bcl-2的活性從而提高內(nèi)源性細胞凋亡通路活性兩方面來提高對腫瘤細胞的殺傷作用。
　　 實驗

6、目的：
　　 本實驗采用PAC-1和低分子柑桔果膠，通過體外實驗進行以下研究：1）PAC-1和低分子柑桔果膠對人結(jié)腸癌細胞增殖及凋亡的影響，進一步從caspase-3、8、9、PARP及bcl-2的表達和細胞周期深入探討其抗腫瘤的機制；2）明確PAC-1聯(lián)合低分子柑桔果膠對人結(jié)腸癌細胞增殖及凋亡的影響并探索其內(nèi)在機制。
　　 方法：
　　 1、細胞株：人結(jié)腸癌細胞株SW116、HCT116、HT-29、SW620

7、和SW480。
　　 2、MTT比色法評價不同濃度PAC-1/低分子柑桔果膠處理上述細胞72h后對上述人結(jié)腸癌細胞的體外增殖抑制作用，并計算PAC-1/低分子柑桔果膠對上述人結(jié)腸癌細胞的IC50，選出對PAC-1敏感和不敏感的細胞各一株。
　　 3、MTT比色法評價IC25、IC50、IC75劑量的PAC-1聯(lián)合5mg/ml劑量的低分子柑橘果膠能否提高對PAC-1敏感和不敏感的細胞株的增殖抑制作用。
　　 4、顯

8、微鏡觀察不同濃度PAC-1處理后上述人結(jié)腸癌細胞的形態(tài)學(xué)變化。
　　 5、流式細胞儀檢測不同濃度PAC-1對敏感和不敏感的細胞株處理后凋亡細胞比例及細胞周期的變化；IC50劑量的PAC-1對敏感和不敏感的細胞株處理不同時間后凋亡細胞比例及細胞周期的變化；IC50劑量的PAC-1聯(lián)合5mg/ml劑量的低分子柑橘果膠對敏感和不敏感的細胞株處理后凋亡細胞比例及細胞周期的變化。
　　 6、Western bloting檢測IC5

9、0劑量的PAC-1單用及聯(lián)合5mg/ml劑量的低分子柑橘果膠對敏感和不敏感的細胞株處理后，凋亡關(guān)鍵蛋白caspase-3、8、9、PARP、Rock-1、bcl-2的蛋白表達水平的變化。
　　 7、采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS13.0進行統(tǒng)計學(xué)分析，兩組間均數(shù)比較實用兩獨立樣本t檢驗方差；多組間均數(shù)比較使用單因素方差分析法，如方差齊用LDS法，方差不齊，用Dunnett-t檢驗方法進行兩兩比較。以P<0.05為具有顯著性差異。所有計量

10、資料以x±s表示。
　　 結(jié)果：
　　 1、PAC-1對5種人結(jié)腸癌細胞株在體外均有明顯的增殖抑制作用，且成劑量依賴。各細胞株對PAC-1的IC50分別是：SW116：22.75±8.70umol/L、HCT116：2.98±1.08 umol/L、HT-29：11.27±2.24 umol/L、SW620 ：3.65±0.21 umol/L和SW480：4.08±1.12 umol/L，其中以SW116最不敏感，HC

11、T116最敏感。因高濃度的低分子柑橘果膠的無法溶解，故MTT實驗無法順利完成。
　　 2、選擇對PAC-1的細胞增殖抑制作用不敏感的細胞SW116和較敏感的細胞 SW620，進行下一步實驗。
　　 3、因高濃度的低分子柑橘果膠無法溶解，因此聯(lián)合作用低分子柑橘果膠選擇細胞增殖抑制作用約50％、可幾乎完全溶解的濃度5mg/ml；聯(lián)合IC25、IC50、IC75劑量的PAC-1作用于SW116和SW620細胞（SW116：

12、IC25≈1/4IC50，IC75≈4 IC50；SW620：IC25≈1/3IC50，IC75≈3 IC50）CI值分別為：IC25的PAC-1+5mg/ml的低分子柑橘果膠：1.54638；IC50的PAC-1+5mg/ml的低分子柑橘果膠：0.57996；IC75的PAC-1+5mg/ml的低分子柑橘果膠：0.80478。低濃度的PAC-1與低分子柑橘果膠聯(lián)合起拮抗作用CI＞1；中、高濃度的PAC-1與低分子柑橘果膠聯(lián)合起協(xié)同作用

13、CI＜1，其中以中濃度的PAC-1聯(lián)合低分子柑橘果膠對結(jié)腸癌細胞的增殖抑制作用最好。
　　 4、顯微鏡觀察不同濃度PAC-1對SW116和SW620細胞處理2h后開始出現(xiàn)細胞形態(tài)學(xué)改變，且隨時間和濃度增加細胞出現(xiàn)的凋亡特征越明顯，如染色質(zhì)的凝聚、細胞膜起泡、細胞核斷裂以及相關(guān)凋亡小體的出現(xiàn)。此結(jié)果與MTT實驗結(jié)果相符。
　　 5、采用流式細胞儀檢測IC25、IC50、IC75劑量的PAC-1作用于SW116和SW62

14、0細胞4、8、24、48h后，流式細胞儀測定凋亡細胞比例發(fā)現(xiàn)：IC25的PAC-1處理后4h凋亡細胞比例與空白對照組相比無顯著性增加（P＞0.05），當(dāng)濃度增至IC50或IC75時凋亡細胞比例較空白對照組顯著增加無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05）。
　　 6、采用流式細胞儀檢測IC25、IC50、IC75劑量的PAC-1聯(lián)合5mg/ml的低分子柑橘果膠作用于SW116和SW620細胞4、8、24、48h后，流式細胞儀測定凋亡細胞比例

15、發(fā)現(xiàn)：與PAC-1單藥相比，相同時間聯(lián)合用藥能顯著增加細胞凋亡比例，無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。
　　 7、PAC-1單用及聯(lián)合低分子柑橘果膠可誘導(dǎo)G0/G1 期細胞增加，G2/M期細胞減少，產(chǎn)生細胞周期阻滯，具有時間和濃度依賴性。
　　 8、應(yīng)用Western bloting方法檢測IC25、IC50、IC75劑量的PAC-1作用于SW116和SW620細胞4、8、24、48h后，凋亡關(guān)鍵蛋白caspase-3、

16、8、9、PARP、bcl-2的蛋白表達水平的情況，發(fā)現(xiàn)：隨時間和濃度增加，caspase-3、8、9、PARP的表達呈逐漸增高趨勢，bcl-2的表達無明顯變化。
　　 9、應(yīng)用Western bloting方法檢測IC25、IC50、IC75劑量的PAC-1聯(lián)合5mg/ml的低分子柑橘果膠作用于SW116和SW620細胞4、8、24、48h后凋亡關(guān)鍵蛋白caspase-3、8、9、PARP、bcl-2的蛋白表達水平的情況，發(fā)現(xiàn)

17、：與PAC-1單藥相比，聯(lián)合用藥后caspase-3、8、9、PARP上調(diào)、bcl-2下調(diào)的趨勢更明顯。
　　 結(jié)論：
　　 1、PAC-1對5種人結(jié)腸癌細胞均有明顯的誘導(dǎo)凋亡和增殖抑制作用。
　　 2、低濃度PAC-1聯(lián)合低分子柑橘果膠對人結(jié)腸癌細胞的增殖和凋亡有拮抗作用；中、高濃度PAC-1聯(lián)合低分子柑橘果膠對人結(jié)腸癌細胞增殖和凋亡表現(xiàn)為協(xié)同作用，以中濃度PAC-1聯(lián)合低分子柑橘果膠的協(xié)同作用效果最佳。<

18、br>　　 3、PAC-1單用及聯(lián)合低分子柑橘果膠能顯著增加caspase-3的活化和PARP的裂解，對caspase-8、9的活化作用不明顯，表明PAC-1是直接高效活化細胞凋亡通路下游的凋亡關(guān)鍵執(zhí)行蛋白caspase-3；聯(lián)合用藥對caspase-9的活化作用優(yōu)于PAC-1單用，Bax/bcl-2的比值也明顯升高，表明線粒體途徑是PAC-1聯(lián)合低分子柑橘果膠誘導(dǎo)人結(jié)腸癌細胞凋亡的機制。
　　 4、PAC-1單用及聯(lián)合低分