人NKp44基因克隆及其大腸桿菌中的表達.pdf

1、一、立題依據(jù)和目的 自然殺傷(NK)細胞來源于骨髓，主要存在于血液和淋巴樣組織，約占外周血淋巴細胞的5-10％。NK細胞屬于淋巴細胞譜系細胞群，是自然免疫反應(yīng)的重要效應(yīng)因子。NK細胞無需抗原刺激，就能殺傷腫瘤細胞或病毒感染細胞，是重要的免疫效應(yīng)/調(diào)節(jié)細胞。 NK細胞的生物學(xué)效應(yīng)依賴于其表面受體和相應(yīng)配體的相互作用。NK細胞受體通過結(jié)合MHCI類分子或其他配體，調(diào)節(jié)NK細胞的活性。NK細胞受體包括免疫球蛋白樣NK細胞受體(

2、KIR、NCRs、LILR、p75/AIRM1等)和C型凝集素樣NK細胞受體(CD94/NKG2，NKG2D，NKp80，NKRP1等)。這些受體顯著的特征是通過抑制或者激活而精確調(diào)節(jié)NK細胞的功能。 抑制性受體信號是通過胞質(zhì)內(nèi)的免疫受體酪氨酸抑制基序(ImmunoreceptorTyrosine-basedInhibitoryMotifs，ITIM)介導(dǎo)的。基于受體/配體間相互作用，ITIM募集特異性磷酸酶(SHP-1，-2)

3、，酪氨酸被磷酸化，這將導(dǎo)致胞內(nèi)激活級聯(lián)反應(yīng)的抑制。許多抑制性受體(KIR，CD94/NKG2，Ly49和LILR)可識別MHCI類分子，這些受體以同源分布型被所有NK細胞所表達；它們與HLAI類等位基因不同類別分子的相互作用使得正常細胞免于NK細胞溶解，這是由于此作用導(dǎo)致了自然細胞毒作用的抑制。NK淋巴細胞只殺傷那些轉(zhuǎn)化為腫瘤或病毒感染細胞，已知它們部分地或全部地喪失了MHCI分子表達能力。這些觀點基于經(jīng)過小鼠和人類實驗數(shù)據(jù)證實的“迷失

4、自我(missingself)”假說。NK細胞不能溶解表達自身MHCI分子的正常組織，而NK細胞的觸發(fā)通過非MHC限制性激活性受體介導(dǎo)來實現(xiàn)。 激活性受體通過偶連在胞內(nèi)區(qū)包含免疫受體酪氨酸活化基序(ImmunoreceptorTyrosineActivatingMotifs，ITAM)的分子，如CD3ζ，F(xiàn)cεRIγ和DAP-12，來轉(zhuǎn)導(dǎo)信號。而ITAM是通過磷酸化之后p72syk和ZAP70胞質(zhì)PTK來實現(xiàn)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性信號的。NK

5、細胞表達的能直接參與自然細胞毒作用的激活性受體，稱為自然細胞毒受體(NCRs)，包括NKp46，NKp44和NKp30。 NCRs屬于免疫球蛋白超家族(Ig-SF)，顯示有一個或兩個Ig-樣胞外區(qū)，在跨膜區(qū)通過含有ITAM分子轉(zhuǎn)導(dǎo)活化信號。特別說明的是，每個NCRs的交聯(lián)都會導(dǎo)致三個結(jié)果：p56lck與p59fyn的激活、NCRs關(guān)聯(lián)多肽的酪氨酸磷酸化以及p72syk和ZAP70胞質(zhì)PTK的活化?！敖换プ饔谩惫δ艿拇嬖谝驳玫浇?/p>

6、發(fā)現(xiàn)的支持，單個NCR的結(jié)合能夠活化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，并介導(dǎo)其它NCR活化信號的放大。這些NK細胞所特有的表面受體，協(xié)同參與NK細胞激活作用，溶解靶細胞。 NKp30基因位于人類染色體6q21.32，編碼30kD的糖蛋白，胞外區(qū)有1個IgV樣結(jié)構(gòu)域，在跨膜區(qū)與CD3ζ分子偶連。NKp30在人類靜息及激活的NK細胞細胞表面均表達。NKp46編碼基因位于人類染色體19q13.42，胞外區(qū)帶有兩個IgC2樣結(jié)構(gòu)域，并在跨膜區(qū)與CD3ζ和F

7、cεRIγ連接，屬于Ⅰ型跨膜糖蛋白，在人類靜息及激活的NK細胞上均表達。NKp46基因存在于嚙齒類動物(大鼠和小鼠)和靈長類動物，如黑猩猩和短尾猿中。 1999年，Cantoni等通過篩選人NK細胞cDNA文庫，發(fā)現(xiàn)一種cDNA，它編碼一種含有276個氨基酸的蛋白，定為NKp44。HUGO命名委員會將其命名為LY95。NKp44基因位于人類染色體6q21.1。像NKp46一樣，NKp44是Ig-SF的一員，屬于Ⅰ型跨膜糖蛋白。此

8、蛋白是以具有21個氨基酸的前導(dǎo)序列、169個氨基酸胞外區(qū)、23個氨基酸跨膜部分、63個氨基酸組成尾部胞內(nèi)區(qū)為特征。編碼蛋白胞外區(qū)帶有1個IgV樣結(jié)構(gòu)域，而在跨膜區(qū)含有一個賴氨酸，通過跨膜區(qū)的賴氨酸與KARPAP/DAP12蛋白在跨膜區(qū)的天冬氨酸殘基連接，實現(xiàn)了胞外區(qū)IgV樣結(jié)構(gòu)域在跨膜區(qū)與KARPAP/DAP12分子連接，并通過其免疫受體酪氨酸活化信號(ITAM)轉(zhuǎn)導(dǎo)活化信號，其傳導(dǎo)途徑配體為ZAP70/Syk。胞內(nèi)區(qū)包含ILYHTV氨

9、基酸序列，是適合ITIM的序列。 NKp44在靜息的NK細胞上不表達，但能選擇性的表達在經(jīng)IL-2誘導(dǎo)的NK細胞上。NKp44,像其它NCR一樣，不結(jié)合經(jīng)典MHCI類分子參與NK細胞激活作用。到目前為止NKp44的特異性配體尚不清楚；要進一步研究發(fā)現(xiàn)人NKp44的相關(guān)配體，需要認識NKp44細胞受體的結(jié)構(gòu)及其識別特異性，從分子水平了解NK細胞生物學(xué)功能。本研究采用基因工程的方法構(gòu)建了人NKp44表達載體，并獲得純化的重組蛋白，為

10、人NKp44功能及相應(yīng)細胞配體的研究奠定基礎(chǔ)。 二、方法和結(jié)果 1.人NKp44基因克隆及序列分析 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫報道人NKp44基因序列，設(shè)計擴增成熟人NKp44基因的兩對引物，其中一對上、下游引物分別在5'端加上限制性酶切位點NcoI和EcoRI，并且上游引物含有起始密碼子ATG，同時加上保護性堿基TA，下游加上CG，降低G+C含量，防止二級結(jié)構(gòu)的形成，提高重組蛋白質(zhì)的表達含量。 取正常人新

11、鮮外周靜脈血，提取單個核細胞，5％CO237℃培養(yǎng)并加入IL-2進行誘導(dǎo)后收集細胞，用異硫氰酸胍一步法分離純化細胞總RNA。以RNA為模板，隨機六聚體核苷酸為引物，在M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶作用下進行反應(yīng)，合成cDNA第一條鏈。 取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，以自行設(shè)計的兩對引物，用TaqDNA聚合酶，進行巢式PCR擴增人NKp44基因。用低熔點瓊脂糖凝膠電泳分離純化PCR擴增產(chǎn)物后，與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α，接種于含1

12、00μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)平板上。用菌落PCR和限制性酶譜分析篩選出陽性克隆。采用ABI3100-AvantGeneticAnalyzer基因分析儀進行測序，結(jié)果顯示，克隆的基因和預(yù)期的成熟人NKp44基因完全一致，成功構(gòu)建了NKp44重組質(zhì)粒pMD18-T-hNKp44。 2.人NKp44基因在大腸桿菌中的表達及重組蛋白的鑒定 用EcoRI和NcoI分別雙酶切重組載體pMD18-T-NKp44和空載體pET30

13、a(+)，再用1％瓊脂糖凝膠電泳分離純化，獲得目的基因片段NKp44DNA及質(zhì)粒載體。利用DNA連接酶將基因片段NKp44DNA與酶切處理載體pET30a(+)連接，使其插入到T7lac啟動子的下游，構(gòu)建表達重組子pET30a(+)-hNKp44。 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入非表達載體大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α，然后接種于含有卡那霉素的LB培養(yǎng)平板上37℃過夜培養(yǎng)。利用菌落PCR，初步篩選陽性重組子。挑選陽性克隆，接種于含有卡那霉素的LB

14、培養(yǎng)液37℃搖床過夜培養(yǎng)。采用樹脂法小量提取質(zhì)粒，然后用XbaI和EcoRI雙酶切鑒定，確定定向插入的陽性克隆。 制備表達宿主菌株BL21(DE3)感受態(tài)細胞，然后用經(jīng)無菌水稀釋表達重組質(zhì)粒1μl(約1ng)，轉(zhuǎn)化入BL21(DE3)，接種于含有卡那霉素LB培養(yǎng)平板上，37℃過夜培養(yǎng)。從新鮮培養(yǎng)平板中挑取單克隆菌落，將含有pET30a(+)-NKp44的BL21(DE3)表達宿主菌株(工程菌株)接種于含卡那霉素的50mlLB培養(yǎng)

15、液中，于37℃搖床培養(yǎng)約3小時，至對數(shù)增長期。加入誘導(dǎo)劑IPTG，繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)3-4小時，4℃4,000rpm5分鐘離心收集菌體。 采用SDS-PAGE電泳和WesternBlotting分析重組蛋白質(zhì)，用Bio-rad垂直電泳系統(tǒng)進行。AIphaInnotechAlphamagerTM2200凝膠圖像掃描系統(tǒng)分析，凝膠干燥儀干燥后保存。結(jié)果顯示，重組蛋白的表觀分子量為35.4kD，和文獻報道一致。重組蛋白約占菌體總蛋白的40％

16、。 為研究重組NKp44的生物學(xué)活性，進行小規(guī)模的發(fā)酵。工程菌以1∶100接種于含Kan的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600約0.5，加入IPTG，繼續(xù)培養(yǎng)4h。4℃離心收集菌體，超聲破碎，離心分離上清和包涵體，進行SDS-PAGE電泳分析顯示重組蛋白存在于包涵體中。在變性劑鹽酸胍存在的條件下，利用His·Bind純化試劑盒純化重組蛋白，透析去除鹽酸胍，PEG8000濃縮目的蛋白，并行SDS-PAGE電泳分析。 三