UMT作為紅色熒光報告蛋白在大腸桿菌的功能和可溶性表達.pdf

1、尿卟啉原III甲基化酶（UMT）是血紅素和西羅血紅素分支合成途徑的關(guān)鍵酶。重組UMT在細胞中積累催化的紅色熒光物質(zhì)西羅葉綠三酸和三甲基咕啉，所以UMT是一種新型熒光報告蛋白。與綠色熒光蛋白相比，UMT的應(yīng)用研究報道較少。本文以大麥和玉米UMT作為報告蛋白，分別研究了不同條件對UMT以及UMT融合蛋白在大腸桿菌的表達水平，結(jié)果如下：
　　1.分析了定向進化的重組大麥UMT功能，和野生型蛋白相比，表達突變體的大腸桿菌細胞熒光強度增加。

2、紫外可見光譜和熒光光譜掃描初步確定熒光物質(zhì)為西羅葉綠三酸和三甲基咕啉。
　　2.探明了不同溫度、IPTG濃度、啟動子和不同菌株對表達兩種大麥UMT的細胞熒光強度的影響。結(jié)果表明，不同條件下，突變體比野生型細胞熒光強度增加。
　　3.驗證了兩種大麥UMT融合不同標簽后蛋白表達的變化。ssrA融合表達的突變體在胞內(nèi)完全降解，而融合表達的野生型則聚集為包涵體；導(dǎo)肽pelB融合的野生型和突變體蛋白，和胞內(nèi)表達相比，熒光降低。

3、　　4.分析了不同菌株、分子伴侶以及5-氨基酮戊酸（ALA）對玉米UMT融合的MBP和TEVp突變體蛋白可溶性表達的影響。在不同菌株中，融合蛋白的熒光強度趨勢一致；共表達分子伴侶對細胞熒光強度無顯著影響；添加外源ALA則影響了TEVp及其突變體融合蛋白的熒光強度。
　　5.分析了玉米UMT分別融合其它蛋白后可溶性表達水平的變化。UMT可以有效指示MBP和TEVp及其突變體的水溶性，但對重組玉米蛋白水溶性的結(jié)果不佳，這和部分蛋白用G

4、FP指示效果一致, N端SUMO標簽對改善蛋白水溶性效果有限。
　　6.分析了玉米UMT作為雙功能報告蛋白篩選可溶性靶蛋白的效應(yīng)。表達UMT融合蛋白的大腸桿菌，菌落數(shù)量與一定濃度的亞碲酸鉀成反比，但在紫外光下觀察到紅色熒光的單菌落，質(zhì)粒經(jīng)酶切驗證與預(yù)期分子量大小一致，SDS-PAGE和蛋白印跡驗證了預(yù)期可溶性融合蛋白的表達。
　　7.分析了UMT上下游代謝相關(guān)酶對玉米UMT作為報告蛋白的影響。5-氨基酮戊酸合酶和尿卟啉原脫羧