慢性病毒性肝炎繼發(fā)肝脂肪變性小鼠模型的建立.pdf

1、背景和目的：
　　 慢性病毒性肝炎是一種嚴(yán)重危害人類健康的常見(jiàn)病、多發(fā)病，疾病后期可發(fā)展為肝硬化、肝癌，嚴(yán)重危害人類健康。近來(lái)肝臟影像學(xué)及病理檢查發(fā)現(xiàn)，部分慢性病毒性肝炎患者伴有脂肪變性，甚至高達(dá)50-72％的HCV感染者出現(xiàn)脂肪肝。肝脂肪變性對(duì)于慢性病毒性肝炎患者肝纖維化進(jìn)展和抗病毒療效均產(chǎn)生重要影響。動(dòng)物模型已經(jīng)為人類研究疾病做出了巨大貢獻(xiàn)，建立各種疾病動(dòng)物模型，現(xiàn)已被視為研究發(fā)病機(jī)制以及探討相應(yīng)治療方法的重要手段。但目前尚

2、缺乏理想的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型來(lái)闡明慢性病毒性肝炎誘發(fā)肝脂肪變性的具體的發(fā)病機(jī)制，從而使得對(duì)其防治的研究受到很大的局限。目前已建立的慢性病毒性肝炎實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型存在體內(nèi)缺乏病原體復(fù)制、與臨床情況顯著不同等局限性，目前尚未見(jiàn)慢性病毒性肝炎繼發(fā)肝脂肪變性的動(dòng)物模型的報(bào)道。
　　 小鼠肝炎病毒(mouse hepatitis virus，MHV)最早于1949年被發(fā)現(xiàn)，屬于冠狀病毒，是一類RNA病毒，可以導(dǎo)致肝臟和中樞系統(tǒng)的疾病和廣泛的免疫功能

3、障礙。其中，MHV-A59型病毒由于其不易感染人，同時(shí)具有嗜肝性與嗜神經(jīng)組織性，一般用來(lái)復(fù)制神經(jīng)脫髓鞘疾病與爆發(fā)型肝炎模型，由于國(guó)內(nèi)對(duì)MHV-A59在細(xì)胞模型的建立及小鼠感染品種與劑量有了一定的研究基礎(chǔ)，本課題所采用小鼠肝炎病毒MHV-A59作為生物致病因子，建立小鼠慢性病毒性肝炎誘發(fā)肝脂肪變性的動(dòng)物模型，為進(jìn)一步在體內(nèi)研究慢性病毒性肝炎誘發(fā)肝脂肪變性的相關(guān)機(jī)制提供適宜的動(dòng)物模型和理論基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 選用6-

4、7周齡的SPF級(jí)C57BL/6小鼠。制備MHV-A59病毒液，將制備的MHV-A59病毒液按10-3、10-4、10-5、10-6、10-7濃度稀釋。C57BL/6小鼠30只隨機(jī)分為5個(gè)濃度組（每組6只小鼠）。5種濃度病毒液分別感染5組小鼠，每只小鼠腹腔注射0.5ml。連續(xù)觀察2周，記錄生存小鼠，按照Reed-Muench法計(jì)算病毒半致死劑量(LD50)，確定實(shí)驗(yàn)中所需病毒的適宜劑量。隨后取C57BL/6小鼠120只隨機(jī)分為4組:①對(duì)照

5、組（以普通飼料喂養(yǎng)）;②高脂組（以高脂飼料喂養(yǎng)）;③病毒組（感染MHV-A59，以普通飼料喂養(yǎng)）;④高脂病毒組（感染MHV-A59，以高脂飼料喂養(yǎng)），高脂飼料配方為:87.6％普通飼料十2％膽固醇+10％豬油+0.4％膽酸鈉。分別于造模第1天和第30天按10-6病毒濃度0.5ml腹腔注射MHV-A59病毒，每周動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)小鼠一般狀況和體質(zhì)量，于造模后第13周末處死小鼠，取血清檢測(cè)MHV抗體（ELISA法）、血清脂質(zhì)和轉(zhuǎn)氨酶（濕化學(xué)法）;小

6、鼠肝臟冰凍切片進(jìn)行油紅O染色，石蠟切片進(jìn)行HE染色。
　　 結(jié)果：
　　 1、小鼠MHV-A59病毒感染后1-2d開(kāi)始出現(xiàn)病毒感染癥狀，死亡高峰出現(xiàn)在第3～5d，按Reed-Mueneh公式計(jì)算LD50=10-5.5，故選用10-6的病毒濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
　　 2、小鼠一般狀況和體質(zhì)量變化結(jié)果:MHV-A59病毒感染導(dǎo)致小鼠食欲下降和體質(zhì)量降低，而高脂飲食合并病毒感染更加重小鼠食欲下降和體質(zhì)量降低。
　　

7、3、小鼠血清MHV抗體檢測(cè)結(jié)果顯示:高脂病毒組和病毒組小鼠血清MHV抗體強(qiáng)陽(yáng)性，對(duì)照組和高脂組陰性。
　　 4、小鼠血清脂質(zhì)水平變化結(jié)果顯示:各組間TG與HDL-C水平無(wú)差異;與對(duì)照組相比，高脂組和高脂病毒組的TC水平增高，差異顯著(P＜0.05)，病毒組的TC水平也高于對(duì)照組，但差異不顯著;與對(duì)照組相比，高脂組和高脂病毒組的LDL-C水平增高，差異顯著(P＜0.01)，高脂病毒組LDL-C水平高于高脂組(P＜0.05)。

8、>　　 5、小鼠轉(zhuǎn)氨酶水平變化結(jié)果:與對(duì)照組相比，其余3組的ALT和AST水平均顯著增高(P＜0.01)。
　　 6、小鼠肝臟HE染色結(jié)果:對(duì)照組小鼠肝細(xì)胞索以中央靜脈為中心向四周呈放射狀排列，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞間緊密聯(lián)系;肝細(xì)胞核大而圓，核仁明顯，胞質(zhì)均勻豐富;匯管區(qū)無(wú)炎性浸潤(rùn)。高脂組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)尚清晰，肝細(xì)胞腫脹、胞質(zhì)疏松呈現(xiàn)空泡狀改變（肝細(xì)胞脂肪變性），少見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。病毒組及高脂病毒組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)稍紊亂，可見(jiàn)不

9、同程度的肝細(xì)胞腫脹、胞質(zhì)疏松，胞質(zhì)空泡狀改變;可見(jiàn)灶性壞死、碎片樣壞死甚至橋接壞死，匯管區(qū)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn);高脂病毒組肝細(xì)胞還可見(jiàn)氣球樣變（肝細(xì)胞脂肪變性）。
　　 7、小鼠肝組織冰凍切片油紅O染色結(jié)果:對(duì)照組小鼠肝細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)無(wú)紅染物質(zhì);高脂組肝細(xì)胞內(nèi)存在彌漫性較粗大的紅染脂滴;病毒組肝細(xì)胞內(nèi)脂滴比高脂組少而細(xì)小;高脂病毒組肝細(xì)胞內(nèi)脂滴比高脂組更密集且更粗大。用Motic Med專業(yè)醫(yī)學(xué)圖像軟件分析油紅O染色圖像，計(jì)算肝