基質(zhì)金屬蛋白酶8在血管生成中的作用機制研究.pdf

1、研究背景:
　　 血管生成(Angiogenesis)是指在已有微血管基礎(chǔ)上形成以毛細血管為主的新生血管系統(tǒng)，其主要步驟包括血管基底膜及細胞外基質(zhì)的降解;內(nèi)皮細胞的遷移、增殖;管狀結(jié)構(gòu)形成;平滑肌細胞和周細胞的附著等。血管生成在胚胎發(fā)育、女性子宮內(nèi)膜血管重建及組織損傷修復(fù)等生理過程中起到重要作用。在某些病理條件下，如風濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病視網(wǎng)膜病變、銀屑病及腫瘤等，血管生成也被證明起到關(guān)鍵作用。
　　 基質(zhì)金屬蛋白酶(Ma

2、trixmetalloproteinases，MMPs)是一類鋅離子依賴性的蛋白內(nèi)切酶，于1962年由Gross在蛙尾實驗中首次發(fā)現(xiàn)，到目前為止已發(fā)現(xiàn)20余種。近年來發(fā)現(xiàn)，MMPs是除內(nèi)皮細胞生長因子之外的另一類與血管生成密切相關(guān)的一個蛋白家族，能調(diào)控多種生理及病理條件下的血管生成。MMP14基因敲除能造成小鼠胚胎血管生成的重大缺陷。MMP13基因敲除能抑制小鼠皮膚創(chuàng)傷愈合時的血管生成。MMP7能誘導(dǎo)臍靜脈內(nèi)皮細胞的增殖，增加裸鼠異種異

3、位移植腫瘤內(nèi)的血管生成。一些基質(zhì)金屬蛋白酶也被證明在血管生成中起到抑制作用，如MMP12、MMP27。人們對MMPs調(diào)控血管生成的機制也做了大量的研究，目前認為，MMPs主要通過影響內(nèi)皮細胞增殖、遷移以及促血管生成因子或血管生成抑制因子的表達及釋放來調(diào)控體內(nèi)、體外血管生成。
　　 基質(zhì)金屬蛋白酶8（MMP8），又稱中性粒細胞膠原酶，最早在中性粒細胞中發(fā)現(xiàn)。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細胞、干細胞、平滑肌細胞、巨噬細胞等均表達MM

4、P8。MMP8在多種細胞的增殖和遷移中起到重要作用。MMP8能促進小鼠中性粒細胞在角膜基質(zhì)中的遷移，促進小鼠胚胎干細胞向內(nèi)皮細胞表面的遷移，增加小鼠主動脈平滑肌細胞的增殖。但是有關(guān)MMP8在內(nèi)皮細胞遷移、增殖及體內(nèi)、體外血管生成過程中的作用尚無報道。
　　 動脈粥樣硬化是冠心病、腦卒中等心腦血管疾病的共同病理基礎(chǔ)，已成為造成人類死亡的首位原因。越來越多的研究表明，斑塊內(nèi)血管生成與動脈粥樣硬化的發(fā)展密切相關(guān)。斑塊內(nèi)新生血管可見于動

5、脈粥樣硬化病程中的各個時期，且病變越重，斑塊內(nèi)新生血管越豐富。這些新生血管一方面能增加斑塊內(nèi)巨噬細胞的浸潤，促進紅細胞來源的膽固醇在脂核中沉積，加重炎癥反應(yīng)，從而促進粥樣斑塊的快速進展;另一方面，斑塊內(nèi)新生血管缺乏細胞外基質(zhì)和平滑肌細胞的支持，較正常血管脆性高，易導(dǎo)致斑塊內(nèi)出血、破裂，引發(fā)嚴重的急性臨床事件如急性心肌梗死、腦卒中等，危及病人生命。
　　 已有研究表明，MMP8在人動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)有表達，且在快速進展的頸動脈粥樣

6、斑塊中表達增加。又有研究證明，MMP8基因敲除能抑制小鼠動脈粥樣硬化發(fā)展中的炎癥反應(yīng)，說明MMP8參與動脈粥樣硬化的進展，但MMP8對動脈粥樣硬化的作用是否與斑塊內(nèi)血管生成有關(guān)，亦無相關(guān)報道。
　　 目的:
　　 1.探討MMP8在內(nèi)皮細胞增殖、遷移及體外血管生成中的作用及相關(guān)分子機制。
　　 2.利用動物模型探討MMP8在體內(nèi)血管生成中的作用。
　　 3.利用apoE/MMP8雙基因敲除小鼠（apoE-

7、/-/MMP8-/-）和對照組小鼠(apoE-/-/MMP8+/+)小鼠建立動脈粥樣硬化動物模型，觀察MMP8對動脈粥樣硬化及斑塊內(nèi)血管生成的影響。
　　 方法:
　　 1.利用編碼MMP8shRNA(shorthairpinRNA，shRNA)的病毒載體和編碼非靶向shRNA(NontargetshRNA)的病毒載體分別感染人臍靜脈內(nèi)皮細胞(Humanumbilicalveinendothelialcells，HUVE

8、Cs)。完成藥物篩選后，以MMP8shRNA組HUVECs和NontargetshRNA組HUVECs為研究對象，用羅氏公司Brdu檢測試劑盒和Ki67免疫熒光染色檢測兩組內(nèi)皮細胞的增殖;用劃痕實驗(Woundscratchassay)測量兩組內(nèi)皮細胞的遷移距離;用體外基質(zhì)膠成管實驗(In-vitroMatrigeltubeformationassay)計算兩組內(nèi)皮細胞的成管數(shù)、成管長度及分支點數(shù)。提取總蛋白，用WesternBlot檢

9、測兩組內(nèi)皮細胞MMP8、CD31、β-catenin的表達。提取核蛋白和胞漿蛋白，用Westernblot檢測兩組內(nèi)皮細胞β-catenin在胞核和胞漿的水平。利用細胞免疫熒光染色，觀察兩組內(nèi)皮細胞β-catenin在胞核和胞漿的分布;用實時定量PCR檢測兩組內(nèi)皮細胞β-catenin目的基因的表達情況。使用血管緊張素Ⅰ(AngiotensinⅠ，AngⅠ)和血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡ，AngⅡ)分別刺激兩組內(nèi)皮細胞，Wes

10、ternblot檢測兩組內(nèi)皮細胞CD31的表達。
　　 2.建立兩套基質(zhì)膠栓(Matrigelplug)血管生成實驗動物模型，評估MMP8在體內(nèi)對血管生成的影響。在第一套基質(zhì)膠栓實驗中，將MMP8shRNA組和NontargetshRNA組臍靜脈內(nèi)皮細胞用PKH26紅色熒光物質(zhì)標記，然后分別與基質(zhì)膠混勻，并注射于兩組apoE-/-/MMP8-/-小鼠皮下。在熒光顯微鏡下計數(shù)兩組基質(zhì)膠栓切片中PKH26熒光標記細胞，以判斷外源性臍

11、靜脈內(nèi)皮細胞在apoE-/-/MMP8-/-小鼠體內(nèi)的存活情況：用HE染色，計算基質(zhì)膠栓中微血管密度及毛細血管密度，以評估兩組臍靜脈內(nèi)皮細胞在apoE-/-/MMP8-/-小鼠體內(nèi)的血管生成情況。在第二套基質(zhì)膠栓實驗中，將血管內(nèi)皮生長因子165(VascularEndothelialGrowthFactor165，VEGF165)與基質(zhì)膠混合，然后分別注射于apoE-/-/MMP8+/+組小鼠和apoE-/-/MMP8-/-組小鼠皮下。

12、用免疫雙標熒光染色，計數(shù)基質(zhì)膠栓中CD144陽性細胞和Ki67/CD144雙陽性細胞，以評估兩組小鼠的血管內(nèi)皮細胞在基質(zhì)膠栓中遷移和增殖情況。通過HE染色，計算基質(zhì)膠栓中的微血管密度，以評估兩組小鼠的血管內(nèi)皮細胞在基質(zhì)膠栓中的血管生成情況。
　　 3.分別留取人胸主動脈瘤和冠狀動脈的標本，制作成石蠟切片，利用免疫組織化學(xué)染色觀察MMP8在兩組臨床標本粥樣斑塊內(nèi)微血管的表達情況。分別給予apoE-/-/MMP8+/+組小鼠和apo

13、E-/-/MMP8-/-組小鼠高脂飲食12周，建立小鼠動脈粥樣硬化動脈模型。使用油紅0染色，測量兩組小鼠主動脈根部粥樣斑塊面積及主動脈縱剖面粥樣斑塊面積指數(shù)，以探討MMP8在小鼠動脈粥樣硬化發(fā)展中的作用;通過免疫組織化學(xué)染色，測量兩組小鼠動脈粥樣斑塊內(nèi)CD31、CD144陽性染色面積和陽性顆粒數(shù)，并計算陽性染色面積比例（陽性染色面積/粥樣斑塊面積）和陽性顆粒密度（陽性顆粒數(shù)/粥樣斑塊面積），以評價MMP8基因敲除對小鼠動脈粥樣斑塊內(nèi)血管

14、生成的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1.未進行病毒感染的內(nèi)皮細胞在嘌呤霉素作用24h后全部死亡。MMP8shRNA組內(nèi)皮細胞和NontargetshRNA組內(nèi)皮細胞在嘌呤霉素作用24h后仍有大量細胞存活。藥物篩選10天后，兩組細胞均表現(xiàn)良好的生長狀態(tài)。MMP8shRNA組內(nèi)皮細胞的增殖、遷移、成管數(shù)、成管長度及分支點數(shù)均較NontargetshRNA組顯著減弱(P＜0.05)。Westernblot結(jié)果顯示，MMP8shR

15、NA組內(nèi)皮細胞總蛋白中MMP8、CD31的表達量較NontargetshRNA組顯著下降（P＜0.05）;MMP8shRNA組內(nèi)皮細胞β-catenin的表達較NontargetshRNA組雖有輕度下降，但無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。提取兩組內(nèi)皮細胞核蛋白及胞漿蛋白，Westernblot結(jié)果顯示MMP8shRNA組內(nèi)皮細胞核內(nèi)β-catenin的水平較NontargetshRNA組明顯減少（P＜0.05）。細胞免疫熒光結(jié)果也進一步證

16、實，MMP8表達下調(diào)能減少β-catenin在內(nèi)皮細胞核內(nèi)的分布。實時定量PCR結(jié)果顯示MMP8shRNA組內(nèi)皮細胞β-catenin目標基因TCF1B、TCF1E、FZD7和CCND1的mRNA水平均較NontargetshRNA組明顯降低（P＜0.05)。10nM血管緊張素Ⅱ作用6h、16h、24h后，兩組內(nèi)皮細胞CD31的表達在以上時間點均顯著上調(diào)（P＜0.05)。10nM血管緊張素Ⅰ作用24h后，NontargetshRNA組內(nèi)

17、皮細胞CD31的表達顯著上調(diào)（P＜0.05)，而MMP8shRNA組內(nèi)皮細胞CD31的表達無顯著變化(P＞0.05)。
　　 2.在第一套基質(zhì)膠栓實驗中，兩組基質(zhì)膠栓中PKH26陽性細胞數(shù)均達到總細胞數(shù)的90％以上，說明兩組外源性臍靜脈內(nèi)皮細胞在小鼠體內(nèi)可以存活，且存活率相對較高。MMP8shRNA組臍靜脈內(nèi)皮細胞在apoE-/-/MMP8-/-小鼠體內(nèi)基質(zhì)膠栓中形成的微血管密度和毛細血管密度均較NontargetshRNA組臍

18、靜脈內(nèi)皮細胞顯著減少（P＜0.05)。在第二套基質(zhì)膠栓實驗中，apoE-/-/MMP8-/-小鼠基質(zhì)膠栓中微血管密度、CD144陽性細胞數(shù)、內(nèi)皮細胞的Ki67陽性比例均較apoE-/-/MMP8+/+小鼠組明顯減少（P＜0.05)。
　　 3.免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示人胸主動脈瘤和冠狀動脈的粥樣斑塊區(qū)含有較多微血管，且微血管的管壁和管腔面均表達大量MMP8。apoE-/-/MMP8-/-和apoE-/-/MMP8+/+兩組小鼠接

19、受高脂飲食12周后，油紅0染色結(jié)果顯示apoE-/-/MMP8-/-小鼠主動脈根部粥樣斑塊面積和主動脈縱剖面粥樣斑塊面積指數(shù)均較apoE-/-/MMP8+/+小鼠明顯減少（P＜0.05）。免疫組織化學(xué)染色顯示apoE-/-/MMP8-/-小鼠粥樣斑塊內(nèi)CD31、CD144的陽性染色面積比例和陽性顆粒密度均較apoE-/-/MMP8+/+組小鼠顯著減少(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.MMP8表達下調(diào)能抑制臍靜脈

20、內(nèi)皮細胞的增殖、遷移及體外血管生成，MMP8的這種作用與AngⅡ/CD31/β-catenin傳導(dǎo)通路相關(guān)。
　　 2.MMP8表達下調(diào)能抑制臍靜脈內(nèi)皮細胞在小鼠體內(nèi)基質(zhì)膠栓中的血管生成。MMP8基因敲除能抑制小鼠血管內(nèi)皮細胞在基質(zhì)膠栓中的增殖、遷移及血管生成。
　　 3.MMP8基因敲除能抑制小鼠動脈粥樣硬化的發(fā)展及斑塊內(nèi)血管生成。
　　 本研究從血管生成的體外模型（增殖、遷移、體外成管實驗）、體內(nèi)模型（基質(zhì)膠