神經(jīng)干細(xì)胞移植治療血管性癡呆大鼠的研究.pdf

1、第一部分:大鼠神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)及慢病毒介導(dǎo)GFP轉(zhuǎn)染的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的
　　原代培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞，并在體外繼續(xù)分裂增殖、穩(wěn)定傳代，慢病毒介導(dǎo)GFP轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細(xì)胞后，可做為移植的種子細(xì)胞，滿(mǎn)足細(xì)胞移植需要。
　　材料與方法
　　以健康孕15天Wistar大鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，體外分離并原代培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞，之后傳代培養(yǎng)，并進(jìn)行單細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)。免疫熒光法和免疫組化SP法對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞分進(jìn)行鑒定，Lentivirus介導(dǎo)轉(zhuǎn)染NS

2、Cs。
　　結(jié)果
　　1.原代培養(yǎng)細(xì)胞可形成數(shù)十個(gè)細(xì)胞聚集而成的小神經(jīng)球(Neurosphere)神經(jīng)球逐漸增大，7天時(shí)神經(jīng)球已生長(zhǎng)成為數(shù)百個(gè)細(xì)胞的大克隆，即可傳代培養(yǎng)。傳代第7天時(shí)已再次長(zhǎng)成為數(shù)百個(gè)細(xì)胞聚集的大克隆，將細(xì)胞連續(xù)傳代，細(xì)胞的生長(zhǎng)模式基本相同。
　　2.原代培養(yǎng)的神經(jīng)球經(jīng)分散、再擴(kuò)增得到的大量神經(jīng)球呈nestin抗原陽(yáng)性;神經(jīng)球可以分化為三種細(xì)胞，免疫熒光法和免疫組化SP法檢測(cè)三種細(xì)胞分別呈NSE、CNP

3、、GFAP陽(yáng)性。
　　3.慢病毒介導(dǎo)GFP轉(zhuǎn)染NSCs后，熒光顯微鏡下觀(guān)察，可見(jiàn)NSCs攜帶綠色熒光。
　　結(jié)論
　　1.從大鼠胚胎（孕15天）腦組織中分離的神經(jīng)干細(xì)胞在體外可繼續(xù)分裂增殖、穩(wěn)定傳代，可滿(mǎn)足細(xì)胞移植需要。
　　2.慢病毒介導(dǎo)GFP轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細(xì)胞，標(biāo)記后的神經(jīng)干細(xì)胞做為移植的種子細(xì)胞，便于在動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行跟蹤研究。
　　第二部分:NSCs移植治療大鼠血管性癡呆
　　目的
　　將慢病毒

4、介導(dǎo)GFP標(biāo)記的NSCs通過(guò)海馬立體定向注射的方法移植到血管性癡呆模型大鼠，使海馬周?chē)腘SCs數(shù)量增加，用Morris水迷宮檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠作定位航行試驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)測(cè)試，檢測(cè)大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力的改變，觀(guān)察NSCs移植的治療效果。
　　材料與方法
　　月齡12～15個(gè)月健康成年Wistar大鼠，體重300～400g，用來(lái)制備血管性癡呆2VO模型;傳代至第6代的Wistar大鼠神經(jīng)干細(xì)胞，GFP標(biāo)記后于2VO模型造模35

5、天后海馬立體定向注射移植，對(duì)假手術(shù)組、對(duì)照組、NSCs移植組海馬組織切片做尼氏染色，觀(guān)察病理學(xué)改變;在缺血4、9、13、17周（移植前和移植后4周、8周、12周）時(shí)對(duì)移植前后各組大鼠行Morris水迷宮測(cè)試，對(duì)定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　結(jié)果
　　1.神經(jīng)干細(xì)胞移植1周后,大鼠海馬區(qū)冰凍切片顯示有綠色熒光存在，證明神經(jīng)干細(xì)胞可在海馬區(qū)域存活、增殖。
　　2.缺血4周時(shí)（移植前），NSCs移植組與對(duì)

6、照組大鼠各項(xiàng)指標(biāo)均無(wú)顯著性差異，但二者與假手術(shù)組相比均有顯著性差異。缺血9、13、17周（移植后4周、8周、12周）時(shí)，NSCs移植組大鼠逃避潛伏期較對(duì)照組均明顯縮短(P＜0.05)，但與假手術(shù)組相比仍明顯延長(zhǎng);NSCs移植組穿越平臺(tái)區(qū)次數(shù)較對(duì)照組也明顯增加(P＜0.05)，與假手術(shù)組相比仍明顯減少(P＜0.01);NSCs移植組大鼠平臺(tái)所在象限停留的時(shí)間百分比較對(duì)照組明顯增加(P＜0.05，移植后12周除外)，但與假手術(shù)組相比仍明顯減

7、少(P＜0.05)。
　　3.NSCs移植組尼氏染色顯示神經(jīng)元丟失、變性情況較對(duì)照組有明顯改善，神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)較完整，胞漿內(nèi)尼氏小體相對(duì)較豐富。
　　結(jié)論
　　神經(jīng)干細(xì)胞移植到VaD大鼠模型中后，可在一定程度上改善VaD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。
　　第三部分:Notch通路在神經(jīng)干細(xì)胞移植治療血管性癡呆大鼠中的作用研究
　　目的
　　檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞移植對(duì)VaD大鼠海馬區(qū)Notch1及Hes1表達(dá)的動(dòng)態(tài)改變，

8、研究神經(jīng)干細(xì)胞移植對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改善與海馬區(qū)Notch1、Hes1表達(dá)的變化是否相關(guān)，探討Notch信號(hào)通路是否參與了神經(jīng)干細(xì)胞移植對(duì)血管性癡呆大鼠模型的治療。
　　材料與方法
　　月齡12～15個(gè)月健康成年Wistar大鼠，體重300～400g，用來(lái)制備血管性癡呆2VO模型;傳代至第6代的wistar大鼠神經(jīng)干細(xì)胞球，GFP轉(zhuǎn)染標(biāo)記后做為移植的種子細(xì)胞，于2VO模型造模35天后海馬立體定向注射移植，對(duì)假手術(shù)組、對(duì)照組

9、、NSCs移植組腦組織海馬區(qū)蛋白樣品進(jìn)行Westernblot檢測(cè)。
　　結(jié)果
　　在缺血9周、13周、17周（移植后4周、8周、12周）的Westernblot檢測(cè)檢測(cè)均提示NSCs移植組Notch1和Hes1表達(dá)水平較對(duì)照組高，有顯著性差異(P＜0.05)，但與假手術(shù)組相比仍明顯較低(P＜0.05);NSCs移植組3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的Notch1和Hes1表達(dá)逐漸下降，呈時(shí)間依賴(lài)性。
　　結(jié)論
　　移植的NSCs激活

10、了Notch1-Hes1通路，該通路可能參與NSCs移植對(duì)血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的修復(fù)。
　　第四部分:神經(jīng)干細(xì)胞移植治療對(duì)血管性癡呆大鼠突觸可塑性的影響
　　目的
　　研究神經(jīng)干細(xì)胞移植治療血管性癡呆大鼠的過(guò)程中是否存在樹(shù)突與樹(shù)突棘的形態(tài)和結(jié)構(gòu)改變，血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改善是否與樹(shù)突和樹(shù)突棘的形態(tài)和結(jié)構(gòu)改變相關(guān)。
　　材料與方法
　　月齡12～15個(gè)月健康成年Wistar大鼠，體重300～40

11、0g，用來(lái)制備血管性癡呆2VO模型;傳代至第6代的wistar大鼠神經(jīng)干細(xì)胞球，GFP轉(zhuǎn)染標(biāo)記后做為移植的種子細(xì)胞，于2VO模型造模35天后海馬立體定向注射移植，對(duì)假手術(shù)組、對(duì)照組、NSCs移植組腦組織海馬CA1區(qū)樹(shù)突的分支及樹(shù)突棘密度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　結(jié)果
　　血管性癡呆對(duì)照組及NSCs移植組樹(shù)突分支數(shù)目與假手術(shù)組相比均明顯減少，有顯著性差異，隨時(shí)間延長(zhǎng)下降趨勢(shì)不明顯;NSCs移植組樹(shù)突分支數(shù)目與血管性癡呆模型對(duì)照組相比