血根堿抗宮頸癌作用及其機(jī)制的研究.pdf

1、惡性腫瘤是當(dāng)前危害人類(lèi)健康的重要疾病之一，對(duì)人類(lèi)生存構(gòu)成最嚴(yán)重的威脅。目前較為成熟的治療方法有手術(shù)、放療、化療及免疫治療等。近年來(lái)，腫瘤化療取得了很大的進(jìn)步，但對(duì)危害人類(lèi)生命健康最嚴(yán)重的、占惡性腫瘤90％以上的實(shí)體瘤的治療效果不盡人意，并且絕大多數(shù)抗腫瘤藥物在抑制或殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)對(duì)正常組織、器官不可避免地產(chǎn)生毒性作用，給患者帶來(lái)痛苦，甚至導(dǎo)致死亡。據(jù)最新癌癥研究統(tǒng)計(jì)，宮頸癌在世界范圍發(fā)病率在女性惡性腫瘤中居第二位，僅次于乳腺癌，且近

2、年來(lái)宮頸癌的年輕病例數(shù)呈逐年增多趨勢(shì)。因此，開(kāi)發(fā)與研究新型有效的抗宮頸癌藥物是生物醫(yī)藥研究領(lǐng)域的重大課題和長(zhǎng)期任務(wù)。
　　最近幾年，使用中草藥來(lái)預(yù)防和治療宮頸癌已成為宮頸癌治療的熱點(diǎn)。尋求能夠抑制腫瘤生長(zhǎng)、引起細(xì)胞周期阻滯、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的中草藥已成為當(dāng)今宮頸癌研究的新領(lǐng)域。血根堿來(lái)源于罌粟科植物博落回的果實(shí)，早期的研究發(fā)現(xiàn)它具有抗炎、抗菌、抗氧化并對(duì)中樞神經(jīng)有麻醉作用，最近的研究表明血根堿在人類(lèi)上皮癌、前列腺癌、人黑

3、色素瘤、結(jié)腸腺癌、乳腺癌等多種腫瘤中均有抗腫瘤作用，但通過(guò)文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，血根堿在宮頸癌方面的缺乏系統(tǒng)研究，對(duì)宮頸癌的作用機(jī)制尚不明確，因此本課題旨在研究血根堿抗宮頸癌作用及其機(jī)制，為更深入開(kāi)展血根堿的基礎(chǔ)和臨床研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。本課題的研究?jī)?nèi)容共分四個(gè)部分。
　　第一部分血根堿抑制宮頸癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡及其機(jī)制的研究
　　目的:研究血根堿在體外對(duì)宮頸癌細(xì)胞HeLa和Siha生長(zhǎng)、周期阻滯和凋亡的影響，并以正常GM

4、和ECV304細(xì)胞作為對(duì)照，初步探討其作用機(jī)制。
　　方法:采用倒置顯微鏡和活細(xì)胞工作站觀(guān)察不同濃度血根堿作用后HeLa、Siha、GM和ECV304細(xì)胞形態(tài)的變化;應(yīng)用MTT和克隆形成法檢測(cè)不同濃度血根堿對(duì)細(xì)胞的生存率的影響;通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析血根堿處理后細(xì)胞周期的變化;DNA凝膠電泳、TUNEL法、堿性“彗星”電泳、Annexin V和PI雙染法檢測(cè)、透射電鏡等手段定性和定量探討血根堿誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡的狀況。采用活性氧檢測(cè)試

5、劑盒和線(xiàn)粒體膜電位檢測(cè)試劑盒測(cè)定血根堿處理后宮頸癌細(xì)胞中ROS的改變和線(xiàn)粒體膜電位的變化。最后用Western blot檢測(cè)血根堿對(duì)細(xì)胞周期和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的變化。
　　結(jié)果:(1)血根堿能夠明顯抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞和Siha細(xì)胞的生長(zhǎng)，并呈時(shí)間依賴(lài)和濃度依賴(lài)關(guān)系，且HeLa細(xì)胞對(duì)血根堿敏感性高于Siha細(xì)胞;(2)血根堿可以引起宮頸癌細(xì)胞周期G2/M期阻滯，并能明顯誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，同時(shí)促發(fā)ROS的生成和引起線(xiàn)粒體膜電位的降低;

6、(3)血根堿明顯下調(diào)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白CyclinB1、CyclinE和CDC2的表達(dá)水平，而上調(diào)了p21和p27的表達(dá)水平;(4)血根堿處理后，凋亡相關(guān)蛋白NF-κB、Bcl-2、Procaspase3、P-Erk、P-P38和P-JNK蛋白表達(dá)水平出現(xiàn)明顯上調(diào)，而Cytochrome C、AIF、Cleaved PARP和P-JNK蛋白表達(dá)水平則出現(xiàn)明顯下調(diào)。
　　第二部分血根堿體外誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞自噬及其機(jī)制的研究
　　目

7、的:研究血根堿在體外誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞自噬及其可能的機(jī)制
　　方法:采用MTT比色法觀(guān)察自噬抑制劑3-MA影響血根堿的宮頸癌細(xì)胞增殖抑制作用;通過(guò)透射電鏡觀(guān)察和MDC染色方法檢測(cè)血根堿處理后宮頸癌細(xì)胞自噬的發(fā)生;應(yīng)用Western blot方法檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3和Beclin1表達(dá)水平。
　　結(jié)果:血根堿處理導(dǎo)致宮頸癌HeLa和Siha細(xì)胞中自噬囊泡明顯增多，并呈濃度和時(shí)間依賴(lài)關(guān)系;自噬抑制劑3-MA可以逆轉(zhuǎn)血根堿對(duì)宮頸癌細(xì)

8、胞生長(zhǎng)的抑制作用。血根堿處理使宮頸癌細(xì)胞中LC3Ⅱ和Beclin1的蛋白表達(dá)水平出現(xiàn)了明顯上調(diào)。
　　第三部分血根堿對(duì)體外宮頸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響及分子機(jī)制研究
　　目的:研究血根堿對(duì)宮頸癌細(xì)胞粘附、轉(zhuǎn)移及侵襲的影響，并探討其作用的初步機(jī)制。
　　方法:通過(guò)貼壁實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)血根堿處理后宮頸癌細(xì)胞粘附能力的影響。采用劃痕實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)血根堿對(duì)腫瘤細(xì)胞體外遷移能力的影響。通過(guò)Boyden小室法檢測(cè)血根堿對(duì)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響;

9、最后用Western blot方法檢測(cè)侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白表達(dá)水平的變化。
　　結(jié)果:血根堿可以抑制宮頸癌HeLa和Siha細(xì)胞的粘附、遷徙、運(yùn)動(dòng)及侵襲轉(zhuǎn)移能力，并呈濃度和時(shí)間依賴(lài)關(guān)系，而且在無(wú)毒性的劑量下也明顯抑制細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。其機(jī)制與上調(diào)了鈣粘附蛋白(E-cadherin)蛋白表達(dá)水平，下調(diào)α-catenin、β-catenin和γ-catenin的蛋白表達(dá)水平有關(guān)。另外也發(fā)現(xiàn)了基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9和VEFG的

10、蛋白表達(dá)水平隨著血根堿濃度的增加而下降;抑癌基因PTEN蛋白的表達(dá)水平則隨著血根堿濃度的增加而增加。
　　第四部分血根堿體內(nèi)對(duì)宮頸癌的抑制作用及其機(jī)制的研究
　　目的:建立裸鼠的宮頸癌移植瘤模型，觀(guān)察血根堿在動(dòng)物體內(nèi)對(duì)宮頸癌生長(zhǎng)的抑制作用，并初步探討其作用機(jī)制。
　　方法:首先將HeLa細(xì)胞接種Babl/C裸鼠臀部，建立裸鼠宮頸癌移植瘤模型;按處理分組為:生理鹽水對(duì)照組、順鉑陽(yáng)性對(duì)照組(5mg/kg，1次/周，iP)、

11、血根堿低濃度組(1.25mg/kg，1次/3天，iP)和血根堿高濃度組(2.5mg/kg，1次/3天，iP)，連續(xù)腹腔注射給藥治療28天，隨后繼續(xù)觀(guān)察28天。期間觀(guān)察動(dòng)物一般生命體征的改變和腫瘤體積變化;實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)觀(guān)察實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組腫瘤周?chē)芤约澳[瘤侵襲轉(zhuǎn)移情況，并取腫瘤進(jìn)行HE染色觀(guān)察腫瘤的病理學(xué)改變及瘤內(nèi)和周邊血管情況;采用免疫組化法檢測(cè)腫瘤組織中CD34、Ki67、EGFR和VEGF的表達(dá)水平;Western blot方法檢測(cè)腫

12、瘤組織內(nèi)Bcl-2、Bax和VEGF蛋白表達(dá)水平;采用透射電鏡檢測(cè)腫瘤組織中細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變。
　　結(jié)果:血根堿在實(shí)驗(yàn)劑量下對(duì)荷瘤裸鼠無(wú)明顯毒副作用，血根堿能夠明顯抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞移植腫瘤的生長(zhǎng)，并呈一定的濃度依賴(lài)性，且這種抑制作用與經(jīng)典化療藥物順鉑的抑瘤療效相當(dāng)。其機(jī)制可能與血根堿能夠抑制腫瘤的血管生成有關(guān)，發(fā)現(xiàn)在血根堿治療的腫瘤組織中CD34、Ki67、EGFR和VEGF的表達(dá)均出現(xiàn)下調(diào)。電鏡結(jié)果顯示血根堿治療組的腫瘤組

13、織中出現(xiàn)了自噬和凋亡共存現(xiàn)象。血根堿治療組腫瘤組織抑凋亡蛋白Bcl-2顯現(xiàn)下調(diào)和促凋亡蛋白Bax則顯現(xiàn)上調(diào)。
　　結(jié)論：本課題分別以宮頸癌HeLa和Siha細(xì)胞為體外研究對(duì)象和裸鼠宮頸癌移植瘤模型為體內(nèi)研究對(duì)象，分別從細(xì)胞，蛋白分子和動(dòng)物研究水平探討了血根堿抑制宮頸癌的抗腫瘤作用，研究結(jié)論總結(jié)如下:
　　1.血根堿可以抑制宮頸癌HeLa和Siha細(xì)胞生長(zhǎng)，并呈劑量依賴(lài)和時(shí)間依賴(lài)關(guān)系。
　　2.血根堿可以誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞發(fā)

14、生G2/M期周期阻滯，其機(jī)制是可能是通過(guò)激活NF-κB，繼而上調(diào)p21和p27表達(dá)，從而抑制Cdc2/CyclinB1復(fù)合物的活性有關(guān)。
　　3.血根堿可以誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，其機(jī)制是(1)通過(guò)上調(diào)Bax蛋白表達(dá)水平和下調(diào)Bcl-2、NF-κB的表達(dá)水平;(2)誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞產(chǎn)生ROS，繼而引起線(xiàn)粒體膜電位的下降，啟動(dòng)了Cytochrome C→Caspase-9→Caspase-3→PARP通路;(3)激活了MAPK信號(hào)通路

15、。
　　4.血根堿可以誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞發(fā)生自噬，LC3和Beclin1蛋白參與了自噬的調(diào)控。
　　5.血根堿可以抑制宮頸癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，其機(jī)制可能包括(1)首先激活上游鈣粘附蛋白(E-cadherin)、α-catenin、β-catenin和γ-catenin的表達(dá)，通過(guò)影響Catenins、E-Cadherin和細(xì)胞骨架之間信號(hào)傳遞的作用，繼而抑制下游基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9活性抑制其侵襲和轉(zhuǎn)移;(2)