腦缺血再灌注損傷后HIF-1α對脈絡(luò)叢細胞的修復(fù)作用.pdf

1、目的:
　　 建立大鼠腦缺血再灌注模型并將體外合成HIF-1α質(zhì)粒通過頸外-頸內(nèi)動脈途徑注射入大鼠腦組織中,應(yīng)用透射電子顯微鏡觀察大鼠脈絡(luò)叢組織在腦缺血再灌注后6h、12h、24h、72h和7d時脈絡(luò)叢內(nèi)皮細胞的細胞器及細胞間連接的超微結(jié)構(gòu)改變,以及外源性HIF-1α基因介導(dǎo)的細胞修復(fù)情況;探索外源性HIF-1α基因?qū)δX缺血再灌注損傷的保護機制。
　　 方法:
　　 1外合成的HIF-1α的cDNA,測序后克隆入

2、真核表達載體pcDNA3.1,克隆片段大小:2.5kb;酶切鑒定重組子,根據(jù)需要體外擴增。
　　 2鼠大腦中動脈腦缺血再灌注模型(MCAO)制作:采用250-280克雄性SD大鼠以10％水合氯醛腹腔麻醉,頸部正中切開,分離暴露頸總動脈分叉部,經(jīng)頸外動脈向頸內(nèi)動脈插入線栓,頸外動脈遠端絲線結(jié)扎,線栓頭端距血管分叉處1.8cm,線栓阻塞大腦中動脈。大鼠神經(jīng)功能缺失評分按Zea Longa評分標(biāo)準(zhǔn)進行評分,MCAO模型建立2h后,選取

3、Zea Longa評分為1-4分者為MCAO成功模型,2h后取出線栓并注入HIF-1α質(zhì)粒,對照組注入PBS。
　　 3留取6h、12h、24h、72h和7d腦組織標(biāo)本觀察,將相應(yīng)時間點實驗組與對照組大鼠處死后斷頭取腦后,視交叉后做2mm厚連續(xù)切片,第一片做TTC染色,其余做石蠟包埋,5μm厚連續(xù)石蠟切片,行HE染色。
　　 4取相同時間點大鼠側(cè)腦室脈絡(luò)叢組織;低溫下迅速取材以4％戊二醛浸泡固定2h(4℃),用0.1mo

4、l/LPBS洗滌,1％鋨酸固定2h(室溫),常規(guī)梯度乙醇及丙酮逐級脫水,環(huán)氧樹脂618＃包埋。用Reichert—Jung超薄切片機做0.5μm厚半薄切片,經(jīng)1％甲苯胺藍-天青Ⅱ染色,光鏡下定位制備超薄切片(片厚50nm)。用醋酸雙氧鈾及枸櫞酸鉛染色,日立-7500透射電鏡觀察腦組織的超微形態(tài)學(xué)改變,了解側(cè)腦室脈絡(luò)叢的損傷變化情況。
　　 5統(tǒng)計學(xué)分析:使用SPSS15.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。組間計量資料比較采用t

5、檢驗,以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1構(gòu)建:HIF-1αcDNA,測序結(jié)果與Genebank記載完全一致(GenBank ID:3091),酶切鑒定后獲得pcDNA3.1-HIF-1α質(zhì)粒,克隆片段大小2.5kb。
　　 2大鼠神經(jīng)功能缺失評分按Zea Longa評分標(biāo)準(zhǔn)進行評分,MCAO模型建立2h后,選取再灌注6h,12h,24h,72h,7d時間點進行觀察,實驗組與對照組在死亡率

6、上無明顯差別,神經(jīng)功能缺失評分上實驗組與對照組無明顯差別。
　　 3在缺血再灌注早期(6h-24h)實驗組與對照組在腦切片TTC染色梗塞面積無明顯差別,再灌注72h以后可見實驗組梗塞面積小于對照組。
　　 4 HIF-1α對腦缺血再灌注損傷大鼠脈絡(luò)叢組織(HE染色)形態(tài)學(xué)變化的影響:缺血再灌注6h后及12h后,脈絡(luò)叢組織形態(tài)結(jié)構(gòu)尚完整,上皮細胞排列整齊,無明顯細胞水腫,細胞間隙大小基本正常,局部可見淋巴細胞浸潤,此時治療

7、組與對照組脈絡(luò)叢組織大致形態(tài)上無明顯區(qū)別。脈絡(luò)叢輪廓存在,大體結(jié)構(gòu)完整,局部可見上皮細胞間隙增寬。缺血再灌注24h后,神經(jīng)組織病理性改變較前面時間點加重,脈絡(luò)叢結(jié)構(gòu)松散,細胞間隙擴大,脈絡(luò)叢上皮細胞高度水腫,部分細胞出現(xiàn)凋亡改變,血管內(nèi)皮細胞腫脹,部分血管內(nèi)皮斷裂,脈絡(luò)叢結(jié)構(gòu)完整性破壞,此時間點觀察到HIF-1α質(zhì)粒治療組破壞程度輕于PBS對照組。缺血再灌注72h后,脈絡(luò)叢上皮細胞凋亡減少,水腫程度未見減輕,與PBS對照組相比HIF-1

8、α質(zhì)粒治療組細胞間隙沒有進一步增寬,且內(nèi)皮細胞破壞減少。缺血再灌注7d后,脈絡(luò)叢組織結(jié)構(gòu)恢復(fù)原有輪廓,上皮細胞腫脹程度減輕,部分區(qū)域可見纖維增生,為無細胞結(jié)構(gòu)的纖維連接,此時間可以觀察到與PBS對照組相比HIF-1α質(zhì)粒治療組上皮細胞恢復(fù)更完整,血管內(nèi)皮細胞輪廓更清晰,細胞間隙較之前緊湊。
　　 5 HIF-1α對大鼠腦缺血再灌注損傷后脈絡(luò)叢細胞超微結(jié)構(gòu)的影響:PBS對照組與HIF-1α注射組在6h和12h均見內(nèi)皮細胞水腫,細胞

9、間緊密連接松解,核膜及各種細胞器損傷,少量吞飲小泡;治療24h后兩組間開始出現(xiàn)差異,HIF-1α注射組吞飲小泡數(shù)量增加較PBS組明顯,且細胞間緊密連接松解相對較少;治療72h后,HIF-1α注射組細胞器及吞飲小泡數(shù)量明顯多于PBS對照組,細胞器水腫現(xiàn)象明顯緩解,細胞間緊密連接開始出現(xiàn)明顯修復(fù)跡象,同HIF-1α注射組相比,PBS對照組細胞間隙較寬,緊密連接恢復(fù)不明顯,細胞間隙封閉和不如治療組;治療7d后,HIF-1α注射組細胞線粒體和粗

10、面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細胞器已恢復(fù)正常,整個內(nèi)皮細胞處于恢復(fù)過程中,PBS對照組細胞器恢復(fù)不如HIF-1α注射組,尤其以分泌型細胞器如粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng),高爾基體等最為明顯,說明其分泌功能的恢復(fù)不如治療組,此時間點HIF-1α注射組細胞間緊密連接已接近正常,而PBS對照組細胞間隙封閉仍不完全。
　　 結(jié)論:
　　 1大鼠腦缺血再灌注損傷后,經(jīng)頸外.頸內(nèi)動脈注射重組pcDNA3.1-HIF-1α質(zhì)?？蓽p少腦組織的梗塞面積,具有神經(jīng)保護作用。<