內源性大麻素在遠程缺血預處理誘導大鼠脊髓缺血耐受中的作用機制研究.pdf

1、背景：缺血再灌注損傷是引起胸主動脈及脊柱手術后發(fā)生截癱的最主要原因。隨著大量新技術的應用，此類手術術后并發(fā)癥已經大大降低，但是近期的一項統(tǒng)計結果顯示，其發(fā)病率仍然超過了10％。因此如何預防胸主動脈及脊柱手術后的缺血再灌注損傷，仍然是個值得關注的課題。遠程缺血預處理是指，在耐受缺血能力較強的器官誘導短暫缺血，使得重要臟器產生缺血耐受的預處理方式，多選擇肢體作為誘導器官。由于其安全，容易被患者和醫(yī)生所接受，因此其臨床應用前景巨大。近來研究表

2、明，內源性大麻素在中樞神經系統(tǒng)損傷方面扮演著重要角色，并且參與了缺血預處理的發(fā)生機制。泛素系統(tǒng)功能異常是導致神經元延遲死亡的重要原因。脊髓缺血損傷后泛素早期的持續(xù)表達增加，被證實與脊髓運動神經元缺血易感性相關。本研究旨在探討遠程缺血預處理對脊髓缺血損傷的保護作用及其機制，為遠程缺血預處理直接應用于臨床提供理論基礎。
　　實驗一肢體遠程缺血預處理在誘導大鼠脊髓缺血耐受中的作用
　　目的：探討肢體遠程缺血預處理在誘導大鼠脊髓缺血

3、耐受中的作用，為進一步機理研究奠定基礎。
　　方法：采用Fogarty導管阻斷胸主動脈血流合并系統(tǒng)低血壓（放血）的方法，制作大鼠脊髓缺血模型。暴露右側股動脈，在股動脈分叉以上處阻斷/開放，進行肢體遠程缺血預處理。雄性SD大鼠40只（300～350g），隨機分為5組（n=8）：假手術組，大鼠接受和其它組動物一樣的手術操作包括置管及麻醉，但不誘導脊髓缺血及遠程缺血預處理；單純缺血對照組，1～2％異氟醚麻醉60min，暴露右側股動脈，誘

4、導脊髓缺血12min；遠程缺血預處理2min組，暴露右側股動脈，阻斷/開放（預處理）3個循環(huán)，每次為2min阻斷/2min開放，遠程缺血預處理30min后，誘導脊髓缺血12min；遠程缺血預處理3min組，暴露右側股動脈，在股動脈分叉以上處阻斷/開放（預處理）3個循環(huán)，每次為3min阻斷/3min開放，遠程缺血預處理30min后，誘導脊髓缺血12min。遠程缺血預處理5min組，暴露右側股動脈，在股動脈分叉以上處阻斷/開放（預處理）3個

5、循環(huán)，每次為5min阻斷/5min開放，遠程缺血預處理30min后，誘導脊髓缺血12min。再灌注24h、48h，由一不了解分組情況的觀察者，評估并記錄運動缺陷評分。評分方法：
　　a)后肢行走：0分正常；1分行走時腳趾在肢體下伸展；2分趾關節(jié)行走；3分靠后肢挪動身體，但是無下肢行走；4分無行走并且后肢無運動。
　　b)放置/踱步反射：0分正常；1分反應弱；2分無踱步反射。每只動物的運動缺陷評分（MDI）為得分a+b。

6、>　　總分6分表示完全癱瘓，0分為功能正常。評分完畢后，截取腰段脊髓組織(L4～L6)，行HE染色。光鏡下觀察HE染色結果并對脊髓前角正常神經元計數。
　　結果：
　　1.生理學參數：脊髓缺血模型制作過程中缺血組間血流動力學指標（PMAP、DMAP、HR），直腸溫度，pH、PaO2、PCO2及血糖變化在各組間均無明顯差異。脊髓缺血期間，各組遠端平均動脈壓力（DMAP）均維持在DMAP<5mmHg，證實導管阻斷合并系統(tǒng)低血壓的

7、方法制作大鼠的脊髓缺血模型阻斷確實，缺血效果可靠。缺血組近端動脈壓（PMAP），在脊髓缺血1min內均由90mmHg降至45mmHg，表明各缺血組在系統(tǒng)低血壓的產生時間及水平上保持一致。4個缺血組大鼠，在脊髓缺血期間，都表現為心率下降，低于缺血前，有統(tǒng)計學差異，但是組間沒有差異。再灌注后5分鐘之內，HR、血壓，都可以恢復到缺血前水平，且缺血組間沒有差別。缺血組再灌注后血糖高于缺血前（p<0.05），pH低于缺血前（p<0.05），整個手

8、術中未出現低氧及二氧化碳潴留。手術過程中，直腸溫度維持在37.2°C～37.5°C之間。各組動物體重，放血量沒有差異。假手術組動物各項生理學參數在整個手術操作過程中保持穩(wěn)定。
　　2.運動缺陷評分(MDI)：再灌注24h、48h，分別對所有動物進行運動缺陷評分。假手術組沒有神經功能改變。預處理3min3個循環(huán)組，MDI低于對照組及其它兩組(P<0.01)，表明運動功能好于其它3組。單純缺血對照組、預處理2min組、預處理5min組

9、MDI沒有統(tǒng)計學差異。
　　3.前角正常神經元計數：在假手術組，未見損傷神經元。預處理3min3個循環(huán)組，前角正常神經元數量多于其它三個缺血組，包括對照組、預處理2min組及預處理5min組(P<0.01)。對照組、預處理2min組及預處理5min組之間，前角正常神經元計數無統(tǒng)計學差異。
　　結論：短暫下肢遠程缺血預處理可以誘導大鼠脊髓的缺血耐受。
　　實驗二大麻素受體在遠程缺血預處理誘導大鼠脊髓缺血耐受中的作用機理研

10、究
　　目的：探討大麻素受體拮抗劑對遠程缺血預處理誘導脊髓缺血耐受的影響，初步證明內源性大麻素在遠程缺血預處理誘導大鼠脊髓缺血耐受的作用機制。
　　方法：雄性SD大鼠64只，隨機分為8組（n=8）。預處理方案為：3個循環(huán)，每次為3min阻斷/3min開放（預處理方案根據實驗一的結果制定）。分組：
　?、賳渭內毖獙φ战M；
　?、谶h程缺血預處理組；
　?、圻h程缺血預處理+AM251組，每次預處理15min前靜脈

11、注射大麻素受體1（CB1）拮抗劑AM251（1mg/kg體重）；
　?、苓h程缺血預處理+AM630組，每次預處理15min前靜脈注射大麻素受體2（CB2）拮抗劑AM630（1mg/kg體重）；
　?、葸h程缺血預處理+溶劑組；
　　⑥AM251組，每次麻醉前15min靜脈注射AM251（1mg/kg體重）；
　　⑦AM630組：每次麻醉前15min靜脈注射AM630（1mg/kg體重）；
　?、嗳軇┙M：每次麻

12、醉前15min靜脈注射大麻素受體拮抗劑溶劑（1ml/kg體重）。
　　所有組動物均接受脊髓缺血損傷，其方法如前所述。再灌注24h、48h，由一不了解分組情況的觀察者，評估并記錄運動缺陷評分。評分完畢后，截取腰段脊髓組織(L4～L6)，行HE染色。光鏡下觀察HE染色結果并對脊髓前角正常神經元計數。
　　結果：
　　1.生理學參數：各組未見差異。
　　2.運動缺陷評分(MDI)遠程缺血預處理組MDI低于單純缺血對照組

13、，遠程缺血預處理+AM251組，（P<0.05）。遠程缺血預處理組與RIPC+AM630組，及遠程缺血預處理+Vehicle組，MDI無差別。單純缺血對照組，遠程缺血預處理+AM251組，AM251組，AM630組，Vehicle組之間沒有統(tǒng)計學差異。
　　3.前角正常神經元計數：遠程缺血預處理組前角正常神經元數量多于單純缺血對照組和預處理+AM251組（P<0.05）。遠程缺血預處理組與遠程缺血預處理+AM630組，及遠程缺血預

14、處理+Vehicle組前角正常神經元計數無差別。單純缺血對照組，遠程缺血預處理+AM251組，AM251組，AM630組，溶劑組之間前角正常神經元計數沒有統(tǒng)計學差異。
　　結論：CB1受體拮抗劑逆轉了遠程缺血預處理誘導的脊髓缺血耐受，表明CB1受體介導了遠程缺血預處理誘導脊髓缺血耐受的機制。
　　實驗三遠程缺血預處理誘導脊髓缺血耐受過程中內源性大麻素含量的變化
　　目的：探討遠程缺血預處理誘導脊髓缺血耐受過程中內源性大

15、麻素含量的變化。
　　方法：雄性SD大鼠24只，隨機分為2組（n=12）：
　?、偃毖獙φ战M。
　　②預處理組。
　　在缺血前即刻，以及缺血再灌注后1h兩個時間點，截取腰段脊髓組織(L4～L6)，每個時間點取動物數量為6只。提取內源性大麻素并利用液相質譜儀（HPLC/MS）檢測內源性大麻素AEA和2-AG的含量。
　　結果：
　　1.生理學參數：生理學參數各組未見差異。
　　2.腰段脊髓AEA和

16、2-AG的含量變化：缺血前，遠程缺血預處理組脊髓節(jié)段內AEA含量要高于缺血對照組(p<0.05)。缺血后兩組間AEA含量并未見統(tǒng)計學差異。單純缺血對照組，缺血后AEA含量高于缺血前(p<0.05)。兩組2-AG的濃度則在缺血前和缺血后均未見明顯變化。
　　結論：遠程缺血預處理可以誘導脊髓節(jié)段內內源性大麻素AEA在脊髓缺血前釋放增加，起到誘導脊髓缺血耐受的作用。
　　實驗四遠程缺血預處理對大鼠脊髓缺血后泛素化的調節(jié)及內源性大麻

17、素的作用
　　目的：探討遠程缺血預處理對大鼠脊髓缺血后泛素化的調節(jié)及內源性大麻素在此過程中的作用。
　　方法：雄性SD大鼠24只，隨機分為3組（n=8）：
　?、賳渭內毖獙φ战M；
　?、谶h程缺血預處理組；
　?、圻h程缺血預處理+AM251組。
　　缺血再灌注后3h，及24h，組織灌注，并截取腰段脊髓組織(L4～L6)，每個時間點動物數量為4只，制作冰凍切片。行免疫組織化學染色觀察脊髓前角泛素的表達及T

18、UNEL染色。免疫組化切片利用image pro plus 6.0軟件計算平均光密度值，分析結果。
　　結果：
　　1.泛素在脊髓前角的表達：免疫組織化學染色結果顯示，泛素在脊髓前角的神經元內有表達，染色陽性信號為淡蘭色顆粒，每張切片隨機選擇10個點計算其平均光密度值，遠程缺血預處理組3小時的泛素表達明顯低于對照組（P<0.001），和遠程缺血預處理+AM251組（P<0.01）；再灌注24h后，遠程缺血預處理組泛素表達明顯

19、低于對照組（P<0.01），和遠程缺血預處理+AM251組（P<0.01）。
　　2.細胞凋亡實驗：在缺血再灌注后3h（早期），各組均未見凋亡細胞。
　　結論：遠程缺血預處理可以抑制脊髓缺血后早期的泛素表達，其原因與遠程缺血預處理誘導內源性大麻素釋放，減輕脊髓損傷有關。脊髓缺血后泛素的表達明顯早于細胞凋亡發(fā)生的時間。
　　小結：
　　1.短暫下肢遠程缺血預處理可以誘導大鼠脊髓的缺血耐受。
　　2.內源性大麻