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文檔簡介
1、結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引起的一種慢性人畜共患病。據(jù)估計,全球約有1/3的人口被結(jié)核感染,準(zhǔn)確、及時地對結(jié)核患者進行診斷是治療和控制結(jié)核所必需的。結(jié)核菌素實驗是臨床診斷結(jié)核常用的方法,也是國際動物衛(wèi)生組織與我國認(rèn)可的法定檢疫方法。但由于結(jié)核菌素可能包含有與其它分枝桿菌相同的抗原組份,檢測時容易出現(xiàn)假陽性,并且此檢測不能區(qū)分自然感染者與卡介苗免疫者。此外還有很多結(jié)核病的診斷方法如細菌培養(yǎng)、痰檢、PCR、IFN-Y診斷法等,但這些方法的缺點是
2、檢測時間長,操作煩瑣,需要昂貴的儀器設(shè)備,而且要有專門的人進行操作等,因此不利于結(jié)核病的檢測。基于以上原因,本實驗研究了兩種新型的結(jié)核檢測方法:
一、建立一種快速、高敏感、高特異、鑒別結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌的方法。實驗根據(jù)大多數(shù)致病性結(jié)核分枝桿菌共有序列esat-6,結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌gyrB共有特異性序列,以及結(jié)核分枝桿菌種特異序列mtp40設(shè)計6對特異性引物對痰液中的結(jié)核分枝桿菌進行檢測,并與鑒別培養(yǎng)基分離培養(yǎng)
3、結(jié)果以及常規(guī)PCR鑒定結(jié)果進行比較。實驗結(jié)果表明,建立的LAMP檢測方法具有很高的特異性??蓞^(qū)分致病性結(jié)核分枝桿菌和非致病結(jié)核分枝桿菌,也可鑒別結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌。LAMP檢測技術(shù)的靈敏度比經(jīng)典PCR技術(shù)高100倍左右,可檢測到7拷貝/反應(yīng)。另外,用三種方法檢測樣品發(fā)現(xiàn),LAMP與細菌培養(yǎng)的符合率為90.91%,LAMP與常規(guī)PCR檢測結(jié)果的符合率為100%。該檢測方法可以在流行病學(xué)調(diào)查及現(xiàn)場快速診斷方面廣泛應(yīng)用,并為臨床治療提供
4、依據(jù)。
二、采用多抗原組合的方法建立一種特異性高,靈敏度好的結(jié)核血清學(xué)診斷方法。利用分子生物學(xué)方法克隆、表達抗原蛋白ESAT-6、CFP10、ACR和Rv2626c,并用蛋白純化試劑盒進行純化。將四種蛋白ESAT-6、CFP10、ACR和Rv2626c按1:1:1:1組合,作為診斷抗原來檢測血清中的結(jié)核抗體。最終以ESAT-6、CFP10、ACR和Rv2626c作為診斷抗原建立了間接ELISA方法,并確定了ELISA診斷方
5、法的判定標(biāo)準(zhǔn),即S/P≥0.235為陽性,S/P<0.202為陰性,0.235>S/P≥0.202為可疑。ELISA方法的特異性為95.8.%、敏感性為65.0%。對20份痰檢陽性和120份健康人血清樣品進行了檢測,并與痰檢結(jié)果比較。20份痰檢陽性血清樣品中有13份為ELISA檢測陽性,陽性符合率為65.0%,120份健康人血清,5份為陽性,其余為陰性,陰性符合率為95.8%,本ELISA方法與痰檢診斷方法總符合率為91.4%。研究表明
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