慢病毒介導的RNA干擾Smad6基因促進骨髓間充質干細胞成骨分化的實驗研究.pdf

1、研究背景：大塊骨缺損的修復是骨科醫(yī)生最常見的遇見的臨床問題。近年來，組織工程技術的發(fā)展日趨成熟，使骨缺損的修復成為可能。理想的組織工程化骨必需具備以下三要素：種子細胞、細胞因子和支架材料。骨髓間充質干細胞是一種具有多向分化潛能的成體干細胞，它在不同的誘導條件下可定向分化為成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞等。又由于骨髓間充質干細胞相對容易獲得，體外培養(yǎng)擴增技術相對較成熟，故而成為骨組織工程中最常用的種子細胞。骨髓間充質干細胞的成骨分化過程中受

2、到多條信號通路的調節(jié)，其中BMP信號通路也是研究最多、最早的一條信號通路。BMPs可通過激活細胞表面的BMP受體來發(fā)揮作用，BMPR受體激活后主要通過多種Smads蛋白在細胞內傳導效應。目前發(fā)現(xiàn)的Smad家族成員至少包括九種蛋白，按功能可分為受體調節(jié)Smads(R－Smads，Smad1、2、3、5、8、9)、共同調節(jié)Smads(Co－Smads，Smad4)、和抑制性Smads(I－Smads，Smad6、7)。其中I-Smads如S

3、mad6和Smad7對BMP/TGF-β信號通路起著負反饋調節(jié)作用。研究表明，Smad6和Smad7對TGF-β和BMP信號通路的阻斷作用具有選擇性：Smad7對TGF-β和BMP通路均有阻斷作用，而Smad6似乎只對BMP信號通路起阻斷作用。因此，我們認為內源性的Smad6在骨髓間充質干細胞的成骨分化過程中起負反饋調節(jié)作用。
　　 目的：針對大鼠Smad6基因設計、構建并篩選出有效的慢病毒干擾載體；體外分離、培養(yǎng)大鼠骨髓間充質

4、干細胞并轉染慢病毒干擾載體，觀察感染后細胞Smad6基因和蛋白的干擾效率，同時觀察Smad6基因抑制后對細胞生物學行為的影響；觀察Smad6基因抑制后對骨髓間充質干細胞體外成骨分化的影響；評價Smad6基因干擾后的骨髓間充質干細胞構建的組織工程化骨對大鼠橈骨干缺損的修復效果。
　　 方法：(1)Smad6基因干擾慢病毒載體的構建：針對大鼠Smad6基因設計并合成兩對特異性干擾片段，連接到pLK0.1質粒中，經大腸桿菌轉化后抽取質

5、粒，經瓊脂糖電泳和測序鑒定后在HEK－293T細胞內包裝慢病毒干擾載體，同時構建陰性對照組慢病毒載體。(2)Smad6基因慢病毒載體的篩選：體外分離擴增大鼠骨髓間充質干細胞，按照梯度稀釋法加入不同數量的慢病毒顆粒過夜感染，篩選能夠達到有效感染效率(80％以上)的最低病毒量作為下一步的實驗條件。按照上述條件以重組慢病毒感染大鼠骨髓間充質干細胞后，定量PCR和Western-Blot分別檢測Smad6基因和蛋白的抑制的效率，觀察基因抑制后細

6、胞細胞形態(tài)的變化，MTS法繪制細胞的生長曲線。(3)體外成骨分化實驗：將細胞分成以下2組：shSmad6組和陰性對照組(NC組)。骨髓間充質干細胞在含有地塞米松、β－甘油磷酸和維生素C的成骨誘導液中誘導培養(yǎng)。檢測方法包括：堿性磷酸酶染色、堿性磷酸酶定量檢測、茜素紅染色、VonKossa染色、RT-PCR及熒光定量PCR檢測成骨相關基因的表達(Runx2、堿性磷酸酶、骨涎蛋白、骨鈣素)。(4)基因修飾的骨髓間充質干細胞修復大鼠橈骨骨缺損的

7、研究：30只大鼠分3組：shSmad6+β-TCP組(n=10)、NC+β-TCP組(n=10)、β-TCP(n=10)，觀察方法包括：X線觀察、HE組織學檢查和骨組織形態(tài)計量分析。
　　 結果：(1)根據大鼠Smad6基因，選擇2個靶點，設計并合成了2對shRNA寡核苷酸片段，并成功連接到pLK0.1載體中，經基因測序鑒定插入片段和設計的片段一致。在HEK-293T細胞內包裝成慢病毒顆粒。(2)重組慢病毒轉染大鼠骨髓間充質干細

8、胞后，經熒光定量PCR和Western-Blot檢測其內源性的Smad6基因和蛋白的表達明顯降低，表明Smad6基因慢病毒干擾載體已成功構建。進一步通過細胞生長曲線和MTS檢測發(fā)現(xiàn)大鼠骨髓間充質干細胞的Smad6基因干擾后細胞增殖未受明顯影響。(3)體外成骨分化實驗顯示shSmad6組堿性磷酸酶的表達明顯高于陰性對照組(p<0.05)，shSmad6組鈣結節(jié)形成的數量明顯多于陰性對照組。shSmad6組Runx2、堿性磷酸酶、骨涎蛋白和

9、骨鈣素的基因表達也明顯高于陰性對照組(p<0.05)。(4)體內修復大鼠橈骨骨缺損的實驗：①X線結果：術后12周：shSmad6+β-TCP組中10只有8只完全骨愈合，NC+β-TCP組10只有4只骨愈合，β-TCP組未見明顯骨愈合。X線療效評分結果顯示shSmad6+β-TCP組明顯高于NC+β-TCP組(P<0.05)；②組織學和組織計量分析結果：術后12周shSmad6+β-TCP組大量的新生骨形成，骨缺損基本完全愈合，NC+β-