三叉神經(jīng)痛大鼠模型中CB1受體的表達變化.pdf

1、1、背景
　　 大麻類植物是人類最早認識的成癮性植物之一，使用大麻來止痛的記載可以追溯到數(shù)百年之前。最近十幾年，隨著內源性大麻素(endogenouscannabinoids，EC)的發(fā)現(xiàn)，以及兩種內源性大麻素受體(cannabinoidtype1receptor，CB1和cannabinoidtype2receptor，CB2)的成功克隆，內源性大麻素系統(tǒng)(endocannabinoidsystem，ECS)的存在已經(jīng)獲得初步

2、證實。CB1、CB2受體都屬于G蛋白偶聯(lián)受體，CB1受體由473個氨基酸，7個跨膜結構域構成。研究發(fā)現(xiàn)CB1受體主要分布于神經(jīng)系統(tǒng)，以腦組織中表達為主，集中分布在大腦的海馬、小腦和紋狀體，多定位于神經(jīng)末梢突觸前膜，發(fā)揮調節(jié)神經(jīng)遞質釋放的作用。在腎上腺，心臟，肺，前列腺，脾臟和扁桃體等外周組織中也有微量表達。CB2受體由360個氨基酸，7個跨膜結構域構成，與CB1受體相反，CB2受體在中樞神經(jīng)元中濃度很低，其主要在免疫系統(tǒng)中存在，包括脾臟

3、、T細胞、扁桃體、(B)細胞及單核細胞中表達，主要發(fā)揮免疫調節(jié)作用，并能夠抑制多種神經(jīng)遞質和細胞因子的釋放。有研究表明CB1受體的拮抗劑可以增強對有害刺激的敏感性，且能夠增強疼痛性神經(jīng)元的活性。另外，CB1受體的激動劑可以抑制疼痛神經(jīng)元的興奮性，并且能夠產(chǎn)生良好的鎮(zhèn)痛效應。相關研究還表明CB1受體能夠減少傷害性疼痛，從而抑制自發(fā)性疼痛的相關行為。
　　 原發(fā)性三叉神經(jīng)痛(Trigeminalneuralgia，TN)是一種神經(jīng)慢

4、性疾病，為三叉神經(jīng)的分支分布區(qū)域里反復發(fā)作的刀割樣陣發(fā)性的劇痛，其特點為三叉神經(jīng)在口腔頜面部的某一分支或者幾個支分支分布區(qū)域內突發(fā)的短暫而劇烈疼痛，并可長期的固定在某一分支，尤以第二、三支多見，亦可幾支同時受累，持續(xù)疼痛時間為數(shù)秒鐘到數(shù)分鐘不等，而間歇期可以沒有任何癥狀，其發(fā)作為自發(fā)性或由面部、口腔內輕微的觸覺刺激所誘發(fā)，大多數(shù)是單側發(fā)病，其中又以中老年人好發(fā)。目前，TN的發(fā)病機制尚不明確，確切的動物模型還難以建立。國內外學者大多認為T

5、N的主要發(fā)病因素是周圍因素，其中的血管壓迫學說得到大多數(shù)學者的親睞，所以，TN的動物模型基本上是通過眶下神經(jīng)(infraorbitalbranchofthetrigeminalnerve，ION)環(huán)扎術來模擬血管壓迫現(xiàn)象，并且在ION支配區(qū)域的表面皮膚進行外在的機械性刺激，以此模擬TN扳機點來獲得。
　　 三叉神經(jīng)脊束核(Spinaltrigeminalcaudalsubnucleus，Vc)從外到內分為五層，在三叉神經(jīng)脊束的內

6、側和延髓的外側。Vc也是口腔頜面部組織的傷害性刺激向中樞傳導的第一道門戶，其尾側亞核及其臨近區(qū)域是軀體感覺的初級感受中樞，傳遞口腔頜面部的傷害性刺激信息。Vc的尾側亞核在細胞構筑上相當于脊髓后角Ⅰ～Ⅵ層。Vc也被認為是面部傷害性傳導通路的二級神經(jīng)元所在區(qū)域，其與痛覺沖動的傳遞和調制有著密切的關系。Vc的Ⅱ層中膠狀質中間神經(jīng)元發(fā)生變性，便喪失了對傳入的疼痛刺激的調節(jié)作用，失去了其對傳入沖動的閘門作用，傳入沖動可以很快達到一定的總和而引起疼

7、痛劇烈發(fā)作。因此我們采用Vc組織來檢測CB1受體的表達變化。
　　 有研究表明，損傷大鼠和猴子的外周神經(jīng)，其存在于脊髓及背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元中的μ-阿片受體表達發(fā)生下降。而在坐骨神經(jīng)(CCI)后的大鼠模型的同側背角的表淺脊髓中CB1受體的表達同損傷大鼠單側神經(jīng)后的對側丘腦區(qū)域內CB1受體的表達均發(fā)生上調。Nomura等和我們的研究團隊的研究也都發(fā)現(xiàn)，對橫斷單側下牙槽神經(jīng)的大鼠鼻口部進行有害和無害的機械性刺激，則Fos和cdk5/p3

8、5蛋白樣免疫反應性在其兩側Vc組織中均可被誘導，并且橫斷的對側少于橫斷側。Vc作為感覺中繼站核，分別接受經(jīng)三叉神經(jīng)傳入的頭面部感覺信息。坐骨神經(jīng)CCI之后CB1受體表達發(fā)生上調的機制仍不明了，但是在該模型中，脊柱CB1受體的表達可能受到蛋白激酶C、酪氨酸激酶受體和相關的細胞內絲裂原活化蛋白激酶的調控。該模型的病理學特征與眶下神經(jīng)慢性壓迫性損傷（chronicconstrictioninjuryontheinfraorbitalbranc

9、hofthetrigeminalnerve，ION-CCI）大鼠模型的病理學特征相類似。
　　 綜合上述的研究背景，本實驗制備了三叉神經(jīng)痛大鼠模型并檢測了各組三叉神經(jīng)痛大鼠模型Vc組織中CB1受體的表達變化。
　　 2、目的
　　 我們假設TN大鼠模型的Vc組織中的神經(jīng)元內存在CB1受體，因為目前仍無TN大鼠模型中CB1受體如何發(fā)揮相關作用方面的論述，此外，延髓下段的Vc組織中的神經(jīng)元接受三叉神經(jīng)的感覺神經(jīng)傳導的

10、相關信息，所以，我們將TN的實驗研究模型定為ION-CCI的大鼠模型，檢驗ION-CCI后大鼠Vc組織中CB1受體的表達變化，目的是為研究CB1受體與TN的臨床治療及致病機理的關聯(lián)性打下實驗基礎。
　　 3、材料與方法
　　 3.1實驗動物分組
　　 同一批次健康成體雄性SD大鼠，體重為300～350g，36只隨機分為6組，每組6只。分為正常組、假手術組、ION-CCI1d組、ION-CCI3d組、ION-CCI

11、7d組、ION-CCI14d組。雄性SD大鼠由南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院動物實驗室以常規(guī)固體飼料飼養(yǎng)，溫度控制在25℃左右，濕度在45％～50％之間，12h明暗循環(huán)（07:00～19:00）。為了消除因為動物行為的隨意性對實驗過程和結果的干擾，減少由此引起的假陽性結果，在實驗開始之前每日08:00開始，用一自制塑料棒敲擊籠壁四周和籠頂、觸摸、提拿大鼠，于大鼠習慣之后，待大鼠平靜時，用一自制毛刷刺激大鼠須墊部，3次/每側，每次刺激需連續(xù)2次，兩

12、次刺激間隔不應少于30秒。兩側交替進行，直致大鼠從開始的抽鼻、探究、恐懼，甚至快速后退逃避、抓咬攻擊等轉為平靜。
　　 3.2暴露并行眶下神經(jīng)結扎術
　　 實驗動物腹腔內注射10％水合氯醛(350mg/kg)，將麻醉效果滿意的大鼠仰臥并固定其頭部和四肢，沿著其右側第一磨牙齦頰側邊緣，向其口鼻方向縱向切開長約1cm的切口，分離暴露ION及周圍約5mm神經(jīng)組織，在肉眼或顯微鏡下使用兩根之間距離大約為2mm的5.0鉻制腸線疏松

13、環(huán)扎ION，結扎ION的緊張度要求是減小ION的直徑，使ION傳導延緩，不可以完全阻滯神經(jīng)表層血管的血液傳導，血液循環(huán)必須通暢。術后6.0縫合線縫合傷口。假手術組大鼠除不結扎ION外，其他方面與手術組大鼠完全相同。所有操作均需在無菌環(huán)境下進行，手術前后無需使用任何抗生素。
　　 3.3測得各實驗組大鼠對電子VONFERY測痛儀所產(chǎn)生機械刺激的反應閾值。
　　 3.4制備ION組織標本和Vc組織標本。
　　 分別稱

14、取各實驗組大鼠的體重，按體重腹腔注10％水合氯醛(350mg/kg)麻醉后，取結扎區(qū)ION進行組織病理學觀察（weil氏和HE染色）。Vc組織的定位按照Paxinos等制定的大鼠腦立體定位圖譜進行定位，切取定好位后的Vc組織，將標記好后的各實驗組大鼠的Vc組織放入冰箱保存(-80℃)。
　　 3.5提取Vc組織抗原蛋白
　　 取出上述標記好的各實驗組大鼠的Vc組織塊用PBS液沖洗，將Vc組織放置于冰上用干凈的剪刀盡量剪碎

15、，再將其放入勻漿器內，每5mg加入300μl配制好的細胞裂解緩沖液后，裂解30min后，用移液槍移至1.5ml空離心管里，隨后離心5min（12000rpm、低于4℃），將上清液取出之后小心放入已經(jīng)準備好的空離心管里，然后置入冰箱冷凍儲存(-20℃)。
　　 3.6測定Vc組織上清液蛋白含量
　　 3.7CB1受體的Westernblotting檢測
　　 4、統(tǒng)計方法與統(tǒng)計軟件
　　 采用SPSS13.

16、0統(tǒng)計軟件對本實驗的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，使用均數(shù)±標準差((x)±s)來表達實驗研究結果，單因素方差分析(One-WayANOVA)和重復測量方差分析(RepeatedMeasures)用于多組間比較，首先進行方差齊性檢驗，如方差不齊，多重比較采用Dunnett's進行檢驗;如方差齊性，多重比較使用Bonferroni進行檢驗;P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。兩組間比較用配對樣本t檢驗分析(Paired-SamplesTTest)，P

17、＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。
　　 5、結果
　　 (1)行為學觀察結果顯示，正常組和假手術組每天疼痛閾值比較并無顯著差異，P均大于0.05。手術組和對照組比較術后疼痛閾值具有顯著差異，P均小于0.05。
　　 (2)組織學觀察結果顯示:正常結構消失，術后縮窄環(huán)區(qū)域神經(jīng)纖維腫脹逐漸明顯;受壓迫神經(jīng)纖維粗細不一致、分布不均勻、甚至發(fā)生變性，被環(huán)扎的神經(jīng)軸突裸露、稀疏、變細、厚薄不一、髓鞘正常結構消失，呈現(xiàn)出蟲蝕

18、狀節(jié)段性脫失和空泡樣改變，連續(xù)性中斷，大量出現(xiàn)許旺細胞。
　　 (3)CB1受體在手術組（ION-CCI1d組、ION-CCI3d組、ION-CCI7d組和ION-CCI14d組）大鼠Vc組織中的含量表達依次上調，但正常組和假手術組大鼠Vc組織中CB1受體含量表達無顯著性差異;假手術組大鼠手術側與對側Vc組織中CB1受體含量表達無差異;ION-CCI14d組手術側與對側Vc組織中CB1受體含量表達有顯著差異。
　　 6、