酶解斑點叉尾鮰內臟制備血管緊張素轉化酶抑制肽及純化工藝研究.pdf

1、斑點叉尾鮰(Ictalurus punctatus)是我國成功引進的淡水魚之一,近年來其養(yǎng)殖量逐年遞增。內臟是水產加工業(yè)的副產物之一,其蛋白含量為11.90％,是較為良好的蛋白質源,對其進行深加工,不但可以增加其附加值,還能起到環(huán)境保護作用。本論文研究了酶解斑點叉尾鮰內臟蛋白制備血管緊張素轉化酶抑制肽工藝、酶解液的純化工藝以及分子量小于1000Da組分的功能特性。
　　 1)斑點叉尾鮰內臟經過脫脂后,得到脂肪含量較低的蛋白。通過

2、篩選得出木瓜蛋白酶為酶解魚內臟蛋白制備血管緊張素轉換酶(ACE)的最適酶,并研究該酶的酶解條件對酶解產物ACE抑制活性的影響。以酶解產物ACE抑制率為指標,通過響應面優(yōu)化得出酶解產物ACE抑制率(Y)與酶解溫度(A)、初始pH值(B)以及液料比(C)之間的二次方程為:
　　 Y(％)=70.74+1.23A+0.98B+0.84C-0.28AB+0.072AC-0.095BC-10.69A2-16.02B2-1.61C2通過軟件

3、分析得到最佳酶解工藝條件為:酶解溫度為55.29℃、pH值為7.51、液料比為2.26,在此水解條件下得到產物的ACE抑制率預期值為70.90％。酶解產物ACE抑制活性與水解度沒有明顯的線性關系。酶解產物氨基酸含量高,其中疏水性氨基酸的含量為39.13g／100g蛋白質。
　　 2)在響應面優(yōu)化得出的最優(yōu)酶解方案下制備酶解液,使用截留分子量分別為1000Da和3000Da的超濾膜對酶解液進行分離純化。酶解液經過超濾被分成3個組分

4、,分子量小于1000Da組分具有較高的ACE抑制活性,其IC50值為1.052mg／mL。通過超濾分子量小于1000Da組分的IC50值由原水解液的1.596 mg／mL降低為1.052 mg／mL。使用葡聚糖凝膠樹脂對分子量小于1000Da,組分進行進一步純化,實驗得出蒸餾水是合適的洗脫劑。分子量小于1000Da組分經過Sephadex G-25過濾得到4個組分,其中組分F2具有較高的ACE抑制活性,其IC50值為1.032mg／mL

5、。使用Sephadex G-15對組分F2進一步純化,得到2個主要組分,其中組分F21具有較高的ACE抑制活性,其IC50值為0.867mg／mL。使用RP-HPLC對組分F21進一步純化,得到的組分H2具有較高的ACE抑制活性,其IC50值為27.46μg／mL。通過質譜分析得出組分H2的分子量為385.67Da,通過估算可知,組分H2為一個由3到4個氨基酸組成的短肽。
　　 3)對分子量小于1000Da組分進行功能性質研究。

6、分子量小于1000Da組分在pH值2.0-10.0范圍內,其溶解度維持在95％左右。分子量小于1000Da組分在中性條件下在較高溫度較長時間加熱過程中能夠保持良好的ACE抑制活性,當加熱溫度在80℃及以下時,分子量小于1000Da組分加熱時間在60min以內,其對ACE的抑制活性能夠維持在63％；分子量小于1000Da組分在90℃加熱60min,其對ACE的抑制活性能夠維持在60％左右。在實驗室溫度條件下,分子量小于1000Da組分在p