木糖發(fā)酵產(chǎn)乙醇尖孢鐮刀菌篩選和基因工程菌構(gòu)建.pdf

1、隨著石油和其他化石能源的日趨枯竭和全球?qū)厥覛怏w排放引發(fā)的氣候變化問題的關(guān)注，開發(fā)新能源成為世界能源發(fā)展的主旋律。利用木質(zhì)纖維素制取燃料乙醇是獲取廉價(jià)、清潔、可再生能源的重要手段，對(duì)緩解能源和糧食危機(jī)，減少環(huán)境污染具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。木糖發(fā)酵是木質(zhì)纖維素資源生產(chǎn)乙醇關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)之一。為獲得良好的木糖發(fā)酵菌種，本研究從腐爛玉米秸稈樣品中，通過(guò)木糖平板、TTC顯色、杜氏管發(fā)酵初篩以及搖瓶液體發(fā)酵測(cè)定乙醇含量復(fù)篩，得到一株產(chǎn)乙醇較高的菌株 c

2、s-28，該菌株不但能進(jìn)行木糖發(fā)酵，同時(shí)也能利用葡萄糖、羧甲基纖維素鈉和玉米秸稈為碳源發(fā)酵產(chǎn)生乙醇，是利用木質(zhì)纖維原料生物轉(zhuǎn)化乙醇的優(yōu)良菌種。經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定其為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）。該菌種已保存于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，菌種保藏編號(hào)為 CCTCC NO：M209040。
　　培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基組分對(duì)尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）發(fā)酵木糖產(chǎn)乙醇影響很大。采用單因子實(shí)驗(yàn)及 Box-Behn

3、ken中心組合設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析法，建立了尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）乙醇產(chǎn)量與木糖、大豆粉和K2HPO4之間的二次多項(xiàng)式回歸模型，得到木糖最適產(chǎn)乙醇的培養(yǎng)基組成為木糖20.725g/L，大豆粉10.29g/L，K2HPO42.785g/L，NaNO32g/L，MnSO40.02g/L，CuSO4?5H2O0.04g/L，KH2PO40.2g/L，CaCl2·2H2O0.1g/L，MgSO4·7H2O0.2g/L。最適發(fā)酵條件：

4、pH值為6.0，裝瓶量為50mL/100mL三角瓶，30℃靜止培養(yǎng)。木糖和葡萄糖混合糖發(fā)酵表明：尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）優(yōu)先利用葡萄糖，而后利用木糖，存在葡萄糖效應(yīng)。
　　為了進(jìn)一步提高尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）的乙醇產(chǎn)量，分別克隆了釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和樹干畢赤酵母（Pichia stipitis）的轉(zhuǎn)醛醇酶基因tal，以質(zhì)粒 pCAMBIA1301為骨架分別構(gòu)建

5、了真菌表達(dá)載體 pCAM-Sctal和pCAM-Pstal。應(yīng)用根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將其分別轉(zhuǎn)入尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）cs-28，轉(zhuǎn)化子經(jīng)Southern blot分析、實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)以及轉(zhuǎn)醛醇酶活性測(cè)定，獲得了遺傳穩(wěn)定的轉(zhuǎn)醛醇酶過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)化子 cs28pCAM-Sctal和cs28pCAM-Pstal。發(fā)酵結(jié)果顯示：與野生型菌株 cs-28相比，利用木糖和葡萄糖發(fā)酵時(shí)，轉(zhuǎn)化子cs28pCAM-Sctal的乙醇產(chǎn)量分別提高

6、了7.35％和8.87%，為6.25g/L和8.89g/L；cs28pCAM-Pstal的乙醇產(chǎn)量分別提高了11.71%和8.39%，為6.50g/L和8.46g/L。轉(zhuǎn)醛醇酶基因的過(guò)量表達(dá)減少了中間代謝產(chǎn)物的積累，增強(qiáng)尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）的木糖代謝能力，從而提高了乙醇產(chǎn)量。
　　乙醛脫氫酶（ALDH）是將乙醛轉(zhuǎn)化成乙酸的關(guān)鍵酶。尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）乙醇合成代謝過(guò)程中，乙酸為主要副產(chǎn)物。為減少尖孢

7、鐮刀菌（F. oxysporum）發(fā)酵過(guò)程中乙酸的產(chǎn)生，本研究應(yīng)用代謝工程策略，敲除尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）中的乙醛脫氫酶基因（aldh），改變其代謝流來(lái)提高乙醇產(chǎn)量。以轉(zhuǎn)醛醇酶基因（pstal）表達(dá)尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）cs28pCAM-Pstal為出發(fā)菌株，從質(zhì)粒 pCSN43及尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）基因組中克隆了具有潮霉素抗性的表達(dá)盒和乙醛脫氫酶基因aldh（注冊(cè)號(hào)為FJ751634）

8、，應(yīng)用正負(fù)雙向篩選載體質(zhì)粒pPZPtk8.10構(gòu)建了aldh基因敲除載體pPZP-HYG-ALDH。利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將pPZP-HYG-ALDH轉(zhuǎn)入尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）cs28pCAM-Pstal中，獲得了 aldh基因突變菌株 cs28pCAM-Pstal-?aldh。木糖和葡萄糖發(fā)酵試驗(yàn)表明：與野生型菌株 cs-28相比，突變株乙酸合成量降低了39.55%和23.10%，為3.01g/L和3.50g/L；乙醇最