地西他濱聯(lián)合紫杉醇對非小細胞肺癌細胞系作用的相關(guān)研究.pdf

1、DNA甲基化是哺乳動物表觀遺傳修飾最為常見的方式,由于其直接參與調(diào)控體內(nèi)多種基因的表達和功能實現(xiàn),與細胞的分化和發(fā)育、基因印記和激活[1]、機體衰老等生命活動息息相關(guān),因此,一旦基因甲基化功能發(fā)生異常,即有可能誘導腫瘤的發(fā)生,尤其是發(fā)生于抑癌基因特定區(qū)域的高度甲基化將導致抑癌基因在轉(zhuǎn)錄時即發(fā)生失活,喪失抑制細胞增殖信號轉(zhuǎn)導及負性調(diào)節(jié)細胞周期的作用[2,3]。
　　miR-200c是新近發(fā)現(xiàn)的一種具有抑制腫瘤細胞生長的抑癌基因,現(xiàn)有

2、研究證實其在高分化腫瘤中的表達水平要高于分化較差、侵襲性較強的腫瘤[4],其作用機制可能與miR-200c表達缺失所介導的腫瘤細胞上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)密切相關(guān)。發(fā)生EMT轉(zhuǎn)化的腫瘤細胞可通過多種方式在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移早期發(fā)揮重要作用,并顯著推進惡性腫瘤的進展,并且同腫瘤細胞對抗腫瘤藥物的療效不佳具有相關(guān)性。目前認為,miR-200c基因啟動子區(qū)域發(fā)生高度甲基化是其在腫瘤細胞內(nèi)失活的主要原因[5],其中TGF-β信號通路可能參與了該可

3、逆性的甲基化之中。miR-200c下游的重要靶點之一便是TUBB3,其3’UTR(3’untranslatedregion)區(qū)能夠與miR-200c核心序列相結(jié)合,并被miR-200c所指導的沉默復合體RISC降解。而TUBB3又是紫杉醇類抗微管藥物療效相關(guān)的重要靶標,其在腫瘤細胞內(nèi)的表達程度同紫杉醇類藥物的療效成負相關(guān)[6]。因此,我們對聯(lián)合運用去甲基化藥物地西他濱與紫杉醇能否提高對非小細胞肺癌細胞系增殖、凋亡的影響,以及該種聯(lián)用是否

4、通過上調(diào)miR-200c影響TUBB3的表達及EMT的功能狀況等進行探討和研究。
　　本實驗以非小細胞肺癌細胞系H1975、H1299為研究對象,隨機分為四組,分別為對照組,地西他濱組、紫杉醇組、聯(lián)合組(地西他濱+紫杉醇處理)。首先采用MTT實驗分別確定地西他濱與紫杉醇的工作濃度,后續(xù)實驗分別以各自的工作濃度進行,H1299細胞系地西他濱工作濃度15.2umol/L,紫杉醇工作濃度為64.9nmol/L;H1975細胞系地西他濱工

5、作濃度18.7umol/L,紫杉醇工作濃度為11.2nmol/L。各組分別按照實驗分組進行處理后置于37℃、5％CO2條件下恒溫培養(yǎng),96h后均以MTT法測得地西他濱組、紫杉醇組及聯(lián)合組對H1299細胞的增殖抑制率(%)分別為:(32.97±2.76)、(55.23±2.20)、(82.51±2.18);H1975細胞的增殖抑制率則為(43.11±2.23)、(47.71±4.74)、(74.67±3.70)。聯(lián)合組同單純地西他濱及單純

6、紫杉醇應用組比較,其增殖抑制率均差異顯著(P<0.05)。流式細胞術(shù)檢測H1299細胞各組的細胞凋亡率(%)分別為:(1.87±0.52)、(19.33±0.57)、(37.03±1.81)、(71.8±1.84);H1975細胞各組的細胞凋亡率分別為:(2.43±0.53)、(16.5±2.61)、(44.13±2.50)、(68.2±2.02)。地西他濱聯(lián)合紫杉醇組同地西他濱組及紫杉醇組比較亦具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。實驗證明

7、,地西他濱與紫杉醇類藥物聯(lián)合運用的協(xié)同抗非小細胞肺癌的作用更明顯。
　　此外,RealtimePCR檢測兩種細胞中miR-200c各組的表達情況,顯示在地西他濱組及聯(lián)合組中,miR-200c的表達水平提高,而在對照組與紫杉醇組中無顯著差異;Luminex液相芯片儀流式熒光法檢測TUBB3mRNA的變化趨勢,提示在地西他濱組及聯(lián)合組中,TUBB3mRNA的表達水平降低,對照組及紫杉醇組無顯著差異;Westernblot法檢測EMT標

8、志物E-cadherin及Vimentin在H1975及H1299中表達情況,地西他濱及聯(lián)合組E-cadherin表達增高而Vimentin下調(diào),同無地西他濱應用組比較存在差異。實驗提示,該種聯(lián)合可能是通過上調(diào)miR-200c的表達進而誘導非小細胞肺癌細胞TUBB3mRNA表達降低及逆轉(zhuǎn)EMT。
　　我們將H1975細胞作為研究對象,以不同濃度梯度的地西他濱處理,96h后倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)學變化,并分別檢測各組細胞中miR-

9、200c,TUBB3及E-cadherin的表達水平,研究結(jié)果發(fā)現(xiàn):對照組H1975細胞形態(tài)呈梭形,為較典型的類間質(zhì)細胞表型,生長狀況良好,數(shù)量較多;而施加不同濃度地西他濱干預的試驗組則在濃度提高至20μmol/L時部分細胞出現(xiàn)梭形的改變,部分出現(xiàn)類似上皮細胞的表型,且細胞數(shù)量少于對照組;miR-200c與E-cadherin隨地西他濱的濃度的增高而表達水平提高;TUBB3mRNA和Vimentin則隨地西他濱的濃度增高表達水平降低。<

10、br>　　綜上所述,我們探討了地西他濱聯(lián)合紫杉醇在非小細胞肺癌細胞系中應用對其增殖、凋亡的影響,通過研究證實了該種聯(lián)用具有協(xié)同作用。且該種聯(lián)用可能是通過上調(diào)非小細胞肺癌細胞內(nèi)的miR-200c的表達水平從而影響TUBB3mRNA的表達,增強了紫杉醇類藥物對非小細胞肺癌細胞的作用。地西他濱的這種上調(diào)miR-200c表達的作用間接誘導了腫瘤細胞發(fā)生MET,且與其濃度水平相關(guān)。由于EMT現(xiàn)象的逆轉(zhuǎn)與對抗腫瘤藥物的療效相關(guān),故認為該種藥物聯(lián)合可