人源蛋白CAP的串聯(lián)SH3結構域與細胞骨架蛋白vinculin相互作用的結構生物學研究.pdf

1、人源蛋白CAP(又稱為Ponsin)，屬于vinexin蛋白家族，是一個重要的參與細胞骨架調(diào)節(jié)的接頭蛋白。在功能方面，CAP對細胞粘著斑(focal adhesion)的形成及其動態(tài)變化的調(diào)控有重要的意義。而CAP與細胞骨架蛋白vinculin的相互作用對CAP在粘著斑處的細胞定位和它的功能的正常行使是必不可少的。但是目前CAP和vinculin相互作用的結構基礎還不太清楚。
　　Vinexin家族蛋白的結構組成高度保守，它們在N

2、末端都有一個SoHo結構域，而C末端包括三個串聯(lián)的SH3結構域。另一方面，Vinculin是一個由1066個氨基酸組成的細胞骨架接頭蛋白，它是由D1，D2，D3，D4，D5五個結構域組成，其中D1-D4結構域組成vinculin的頭部，而D5結構域被看作vinculin的尾部結構域。Vinculin的頭部結構域和尾部結構域之間通過一段富含脯氨酸的柔性區(qū)域連接。根據(jù)文獻報道，CAP的C末端的第一個和第二個SH3結構域負責與vinculin

3、的富含脯氨酸的柔性區(qū)域結合。
　　我們利用核磁共振波譜學技術解析了CAP的第一個和第二個SH3串聯(lián)結構域的溶液結構。進一步，我們通過ITC和化學位移擾動實驗找到了CAP在vinculin上確切的結合位點，并且發(fā)現(xiàn)CAP的SH3串聯(lián)結構域?qū)Φ孜镉胁煌倪x擇特異性。CAP結合vinculin的時候是兩個SH3結構域同時結合到vinculin的富含脯氨酸的序列。我們同時解析了兩個SH3結構域分別與各自底物的復合物晶體結構，通過結構分析找

4、到了決定兩個SH3結構域viculin結合選擇特異性的關鍵殘基，Q807SH3a和D881 SH3b，通過對這兩個位點進行單點殘基突變進一步驗證了上述實驗結果。
　　我們通過核磁共振NOE實驗，核磁主鏈弛豫實驗和殘留偶極耦合(RDC)實驗對串聯(lián)SH3結構域在自由狀態(tài)和結合底物狀態(tài)下的結構變化和動力學性質(zhì)進行了分析。結果發(fā)現(xiàn)，串聯(lián)SH3結構域在自由狀態(tài)下兩個結構域之間不存在任何結構域間相互作用，而在底物結合狀態(tài)下，雖然在底物束縛下兩

5、個結構域變得更加收斂但是仍然沒有固定的相對取向。
　　在功能上，vinculin存在從自抑制狀態(tài)到激活的過程，該過程涉及vinculin結構上頭部和尾部之間較大尺度的構想變化。為了了解CAP對vinculin的激活的影響，我們迸一步利用小角散射、電鏡實驗、和分子動力學模擬技術得到了CAP與vinculin全長蛋白的復合物分子模型，并且分析了可能存在的構象變化。我們也通過超速離心共沉淀實驗來檢測CAP是否可以幫助vinculin結合