非小細(xì)胞肺癌CT灌注參數(shù)與EGFR、MMP-9的相關(guān)性研究.pdf

1、第一部分非小細(xì)胞肺癌CT灌注參數(shù)與EGFR、MMP-9表達(dá)的相關(guān)性研究
　　 研究背景和意義簡介:
　　 CT灌注作為一種無創(chuàng)、定量的檢查方法，其評估腫瘤血管生成的價值在過去的20年中得到了廣泛的認(rèn)可。諸多研究表明幾個CT灌注參數(shù)與腫瘤微血管密度及VEGF等基因的表達(dá)存在相關(guān)關(guān)系。但此類研究所選取的目的基因多數(shù)局限于VEGF，且采取免疫組化這一非定量手段作為基因表達(dá)程度的測定方法，不適合此類定量研究。
　　 EG

2、FR作為腫瘤細(xì)胞周期和血管生成的調(diào)控靶點，也是目前非小細(xì)胞肺癌分子靶向藥物的治療靶點。許多研究表明，其表達(dá)程度與腫瘤的生物學(xué)行為以及分子靶向藥物的有效性關(guān)系密切，因而對腫瘤預(yù)后的評估及治療方案的制定具有指導(dǎo)意義。但其表達(dá)程度的測定只能建立在手術(shù)獲取腫瘤組織的基礎(chǔ)上進(jìn)行。另一方面，EGFR作為一個已知的血管生成因子，能夠促進(jìn)血管生成，其表達(dá)程度與VEGF表達(dá)程度也存在著相關(guān)性。因此，依賴EGFR的促血管生成作用，其表達(dá)程度就有可能與反映腫

3、瘤血管生成情況的CT灌注參數(shù)建立關(guān)系。
　　 MMP-9能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜，與腫瘤轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。另一方面，其破壞血管內(nèi)皮完整性、改變血管通透性的作用已被之前研究證實。因此，依賴此作用，腫瘤組織增大的血管通透性就有可能被CT灌注參數(shù)PMB的改變所反映。
　　 基于上述假設(shè)和存在的問題，我們選取之前研究未涉及的兩個基因EGFR、MMP-9作為靶點，并采取之前此類研究未使用過的RT-PCR這一更為準(zhǔn)確的方法作為基因表達(dá)

4、程度的測定工具，定量分析這兩個基因的表達(dá)程度與各灌注參數(shù)之間的相關(guān)關(guān)系。
　　 目的:
　　 建立CT灌注成像參數(shù)與非小細(xì)胞肺癌腫瘤組織EGFR、MMP-9表達(dá)量的相關(guān)模型，在此基礎(chǔ)上探討利用CT灌注這一無創(chuàng)手段評估腫瘤兩個基因表達(dá)情況的價值。
　　 材料和方法:
　　 1.研究對象
　　 從2012年6月至2013年3月，收集我院疑“肺占位”行胸部CT增強檢查的患者，對其進(jìn)行CT灌注掃描，并利用

5、CT引導(dǎo)下穿刺術(shù)獲取腫塊組織樣本，最后通過手術(shù)、病理、生化等檢查確診為非小細(xì)胞肺癌者共21例。其中男12例，女9例;年齡范圍36～75歲，平均年齡59.81±11.39歲。另取10例肺部良性病變患者組織樣本作為相對表達(dá)量測定的陰性對照，男7例，女3例;年齡范圍30～73歲，平均年齡51.90±14.82歲。
　　 2.CT灌注成像
　　 采用西門子Somatom Definition雙源CT(Germany);雙筒高壓注

6、射器;非離子型對比劑碘海醇(350mgI/ml)注射液;后處理工作站CT workplace(Syngo2008G; Siemens Medical Solutions; Germany)。
　　 首先對患者進(jìn)行CT平掃。灌注層面在上述平掃所得圖像的基礎(chǔ)上進(jìn)行選擇;以平掃所見腫瘤最大層面為中心，采用軸掃方式進(jìn)行多層連續(xù)動態(tài)增強掃描;若所選層面腫瘤壞死廣泛，則酌情選取實性成份較多的鄰近層面作為中心層面。曝光條件100kV，120m

7、As;旋轉(zhuǎn)時間1s;層厚5mm;重建間隔5mm;z軸覆蓋28.8mm;探測器寬度24mm×1.2mm;重建卷積核B30，F(xiàn)OV353mm。對比劑注射方案:采用雙筒高壓注射器注射碘海醇(350mgI/ml)，總量50ml，速率6ml/s;隨后以6ml/s速率跟注60ml生理鹽水。掃描于造影劑注射開始時延遲7s啟動;采集次數(shù)31;采集間隔1s;采集總時間為31s，獲取共155幅的圖像序列。
　　 灌注圖像后處理待穿刺術(shù)后且得到明確的

8、病理結(jié)果后進(jìn)行，使用后處理工作站(CT workplace; Siemens)中的VPCT Body(Syngo2008G; Siemens MedicalSolutions; Germany)軟件包進(jìn)行分析。圖像加載完畢之后，首先對圖像進(jìn)行運動校正。之后，手動剔除仍然無法校正或由于對比劑進(jìn)入大血管而產(chǎn)生嚴(yán)重的星芒狀偽影引起曲線較大波動的圖像。ROI采取手動繪制，參照之前CT引導(dǎo)下穿刺CT圖像，盡量選取取材區(qū)域位置的組織進(jìn)行分析。軟件計

9、算生成ROI的BF、BV、TTP、PMB四個參數(shù)的偽彩圖。記錄各灌注參數(shù)數(shù)值，以及X線輻射劑量。
　　 3.組織標(biāo)本采集和貯存
　　 本研究采用CT引導(dǎo)下經(jīng)皮肺穿刺活檢的方法對腫瘤組織進(jìn)行取樣，并進(jìn)一步利用RNAlater溶液保存樣品。采用西門子SOMATOM PLUS4 CT掃描儀;全自動活檢穿刺搶(PAJUNK(R)，德國)，胸穿包，金屬體表標(biāo)記物;Eppendorf管、RNAlater溶液(Omega Bio-Te

10、k，美國)。
　　 術(shù)前完善患者臨床檢查，禁食4h。術(shù)者根據(jù)CT片顯示病變的部位為患者選擇相對舒適的體位。
　　 首先對患者進(jìn)行CT平掃，根據(jù)CT圖像確定穿刺點、進(jìn)針方向、角度及深度等。穿刺點消毒后，行局部麻醉至胸膜，在患者屏氣時快速進(jìn)針至病灶后再次對病灶掃描，以確定針尖在病灶內(nèi)的位置，當(dāng)穿刺針尖達(dá)到預(yù)定位置后切割取材。一般切割槽內(nèi)可獲得1.5～2.0cm×0.1cm大小的線頭蟲樣組織標(biāo)本。將標(biāo)本浸入盛有RNAlater

11、溶液的Eppendorf管中。并進(jìn)一步移至-20℃條件下貯存。
　　 4.RT-PCR測定基因相對表達(dá)量
　　 取出組織標(biāo)本，經(jīng)過“組織總RNA抽提→去基因組→總RNA純度和完整性檢測→逆轉(zhuǎn)錄→定量PCR”幾個步驟，用2-△△Ct法計算計算出每個腫瘤組織樣本EGFR、MMP-9兩個基因相對對照樣本的相對表達(dá)量。反應(yīng)條件:50℃2min;95℃2min;95℃15s，60℃32s讀板，40 cycles;融解曲線分析:溫度

12、60℃-95℃。每個樣品重復(fù)實驗三次，結(jié)果取平均值。所使用的試劑和設(shè)備詳見正文。
　　 5.統(tǒng)計學(xué)分析
　　 計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((X)±S)表示。采用SPSS13.0版本對各組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。兩樣本間比較采用兩獨立樣本t檢驗，兩樣本非正態(tài)分布時采用Mann-Whitney U檢驗（正態(tài)性檢驗采用單樣本K-S擬合優(yōu)度檢驗，方差齊性檢驗采用Levene's檢驗），兩個率的比較采用x2檢驗;肺癌CT灌注參數(shù)BF、BV

13、、TTP、PMB與EGFRmRNA、MMP-9 mRNA的相對表達(dá)量(2-△△Ct)之間的相關(guān)分析采用Pearson's相關(guān)性檢驗，雙變量不滿足正態(tài)分布者采用Spearman相關(guān)性檢驗。P＜0.05認(rèn)為差異存在統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1.臨床資料統(tǒng)計
　　 21例腫瘤標(biāo)本經(jīng)病理檢查均為NSCLC，其中鱗癌7例，腺癌13例，大細(xì)胞癌1例;10例肺部良性病變患者中，7例慢性炎癥，2例為充血水腫的肺組織伴輕度

14、纖維增生，1例為炎性假瘤。肺癌組與對照組之間性別(x2=0.472，P=0.492)、年齡(t=-1.640，P=0.112)無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 （注:對照組不參與的相關(guān)分析，僅作為RT-PCR計算相對表達(dá)量的陰性對照）
　　 2.CT檢查X線輻射劑量
　　 21例受檢者CT灌注掃描的平均DLP為418.0mGy*cm，胸部平掃平均DLP為513.9mGy*cm，平均總DLP為1421.6mGy*cm;與常規(guī)檢

15、查相比，本研究所采用的灌注掃描方案輻射劑量為胸部平掃劑量的0.81倍，占檢查總劑量的29.4％。
　　 3.EGFR、MMP-9 mRNA表達(dá)情況
　　 肺癌組EGFR mRNA表達(dá)顯著高于對照組(Z=-2.747，P=0.006)，高表達(dá)者占肺癌組總數(shù)的76.19％;肺癌組MMP-9 mRNA表達(dá)顯著高于對照組(Z=-2.197，P=0.028)，高表達(dá)者占66.67％。
　　 4.各灌注參數(shù)與EGFR、MMP

16、-9表達(dá)量相關(guān)性
　　 相關(guān)分析示:BF(r=0.213，P=0.353)、BV(r=0.403，P=0.070)、PMB(r=0.153，P=0.507)與EGFR表達(dá)無顯著相關(guān)性，但存在不同程度的相關(guān)趨勢，以BV最為明顯;TTP與EGFR表達(dá)無顯著相關(guān)性，相關(guān)趨勢亦不明顯(r=0.035，P=0.881)。PMB與MMP-9表達(dá)存在顯著相關(guān)(r=0.474，P=0.030); BF(r=0.227，P=0.323)、BV(r

17、=0.272，P=0.233)與MMP-9表達(dá)相關(guān)性不顯著，但存在相關(guān)趨勢;TTP與MMP-9表達(dá)無顯著相關(guān)性及相關(guān)趨勢(r=-0.004，P=0.987)。
　　 結(jié)論:
　　 1.NSCLC病人腫瘤組織EGFR的表達(dá)程度與CT灌注參數(shù)BF、BV之間相關(guān)性不顯著，但存在相關(guān)趨勢，推測其原因可能由于EGFR影響了腫瘤血管生成，并在一定程度上由代表血流量和血容量的參數(shù)BF、BV所反映，但此作用尚不夠顯著以構(gòu)成統(tǒng)計學(xué)意義。<

18、br>　　 2.與BF相比，BV與腫瘤組織EGFR表達(dá)的相關(guān)趨勢更高，提示EGFR調(diào)節(jié)腫瘤血管生成的誘導(dǎo)作用可能更多體現(xiàn)在改變血管形態(tài)這一方面。
　　 3.NSCLC病人腫瘤組織MMP-9的表達(dá)程度與CT灌注參數(shù)PMB之間存在顯著正相關(guān)，這可能是由于MMP-9升高了血管內(nèi)皮細(xì)胞的通透性并促進(jìn)了腫瘤微血管基底膜的降解，使得血管內(nèi)皮完整性降低，而最終導(dǎo)致代表血管通透性的參數(shù)PMB升高。
　　 第二部分非小細(xì)胞肺癌CT灌注參

19、數(shù)與EGFR基因突變的關(guān)系
　　 研究背景和意義簡介
　　 EGFR基因酪氨酸激酶功能區(qū)18-21號外顯子的突變是目前世界范圍內(nèi)公認(rèn)的非小細(xì)胞肺癌分子靶向藥物治療有效的前提，在臨床工作中被廣泛應(yīng)用于分子靶向藥物治療有效群體的篩查。而目前突變的檢測有賴于手術(shù)獲取腫瘤標(biāo)本。與野生型相比，突變型腫瘤EGFR活性增強，而作為促血管生成因子，之前研究證實EGFR的活性增強可導(dǎo)致VEGF表達(dá)和活性上調(diào)，進(jìn)一步可促進(jìn)腫瘤血管生成。

20、r>　　 近幾年已有幾項關(guān)于EGFR突變型與野生型腫瘤影像學(xué)差異的研究，如兩種類型腫瘤CT平掃征象差別的分析(發(fā)表于Radiology)和PET/CT標(biāo)準(zhǔn)攝取值的差異，但目前尚無關(guān)于CT灌注方面的研究。
　　 CT灌注作為一種無創(chuàng)、定量的檢查方法，其評估腫瘤血管生成的價值在過去的20年中得到了廣泛的認(rèn)可。諸多研究表明幾個CT灌注參數(shù)與腫瘤微血管密度及VEGF等基因的表達(dá)存在相關(guān)關(guān)系。那么，EGFR突變型與野生型腫瘤在血管生成方

21、面的差異是否能夠被CT灌注參數(shù)無創(chuàng)的檢測到呢？如果可以，那么CT灌注參數(shù)是否可以進(jìn)一步作為EGFR存在突變與否的預(yù)測指標(biāo)呢？基于此假設(shè)，我們開展了本項研究。
　　 目的:
　　 通過比較EGFR突變型與野生型非小細(xì)胞肺癌病人的CT灌注參數(shù)之間的差別，以達(dá)到利用CT灌注參數(shù)為判斷EGFR突變情況提供幫助的目的。
　　 材料和方法:
　　 1.研究對象
　　 研究對象的一般資料、納入標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)同第

22、一部分。研究對象分組:根據(jù)病人肺癌組織EGFR基因的18、19、20、21號4個外顯子之一是否存在突變，將21例肺癌病人分為EGFR突變型組和EGFR野生型組。其中突變型組共9例，男4例，女5例;年齡范圍36～75歲，平均年齡57.44±12.63歲;野生型組12例，男8例，女4例;年齡范圍43～73歲，平均年齡61.58±10.57歲。
　　 2.CT灌注成像:
　　 利用CT灌注成像獲得腫瘤的BV、BF、TTP、PM

23、B四個參數(shù)，具體方法步驟同第一部分。
　　 3.組織標(biāo)本采集和貯存
　　 本研究采用CT引導(dǎo)下經(jīng)皮肺穿刺活檢的方法對腫瘤組織進(jìn)行取樣，取出的組織樣品浸入10％甲醛固定液內(nèi)，具體方法步驟詳見第一部分。浸泡于甲醛固定液中的組織進(jìn)一步進(jìn)行石蠟包埋，制作石蠟切片。
　　 4.EGFR基因突變檢測(PCR熒光探針法)
　　 本研究樣本取材后，由我院病理科制作石蠟組織切片，并交送我校**省分子腫瘤病理重點實驗室進(jìn)行E

24、GFR突變檢測。儀器和器材詳見正文，主要步驟包括“石蠟組織DNA提取→EGFR基因熒光檢測→檢測結(jié)果判定”。
　　 本研究使用人EGFR基因突變檢測試劑盒(Human EGFR mutation detectionkit)吉菲源（上海源奇生物醫(yī)藥科技有限公司），采用PCR體外擴(kuò)增的方法以及實時熒光Taqman探針法，通過熒光信號的變化來檢測標(biāo)本中EGFR(exon18)、EGFR(exon19)、EGFR(exon20)、EGF

25、R(exon21)突變情況。根據(jù)標(biāo)本內(nèi)參基因Ct值＜38或≥38來分情況判斷，詳見正文。
　　 5.統(tǒng)計學(xué)分析:
　　 計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((X)±S)表示。采用SPSS13.0版本對各組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。兩樣本間比較采用兩獨立樣本t檢驗，兩樣本非正態(tài)分布或方差不齊時采用Mann-WhitneyU檢驗（正態(tài)性檢驗采用單樣本K-S擬合優(yōu)度檢驗，方差齊性檢驗采用Levene's檢驗），對存在統(tǒng)計學(xué)差異的灌注參數(shù)進(jìn)一步作

26、ROC曲線以評價其預(yù)測EGFR突變的判別效果，兩個率的比較采用x2檢驗。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1.臨床資料統(tǒng)計
　　 EGFR突變型組9例，在本研究中突變發(fā)生率為42.9％;其中exon18、exon19、exon20、exon21四個外顯子的突變例數(shù)分別為0、5、1、4（其中一例同時存在exon19、exon20兩個位點的突變）;腫瘤標(biāo)本經(jīng)病理檢查，鱗癌2例，腺癌7例。EGFR

27、野生型組12例中鱗癌5例，腺癌6例，大細(xì)胞癌1例。兩組組之間性別(x2=1.037，P=0.309)、年齡(Z=-0.712，P=0.476)無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 2.EGFR突變型組與EGFR野生型組間灌注參數(shù)的比較
　　 EGFR突變型組的四個灌注參數(shù)BF(t=1.939，P=0.070)、BV(t=1.567，P=0.134)、TTP(t=0.106，P=0.917)、PMB(t=1.146，P=0.266)均高于

28、野生型組，且BF、BV之間的差別較明顯，各參數(shù)組間差異均無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 3.灌注參數(shù)預(yù)測EGFR突變的ROC曲線分析
　　 ROC曲線分析中，我們選取灌注參數(shù)BF、BV和PMB來預(yù)測EGFR的突變情況。ROC曲線下面積分別為BF:0.741(95％ CI:0.516-0.966，P=0.065，SE=0.115)、BV:0.648(95％ CI:0.401-0.895,P=0.256, SE=0.126)、PMB:

29、0.583(95％CI:0.329-0.838，P=0.522，SE=0.130)，三者預(yù)測均不具有統(tǒng)計學(xué)意義。當(dāng)BF取值32.475時，其預(yù)測EGFR突變的靈敏度為88.9％，特異度為77.7％，約登指數(shù)為0.556，達(dá)到最大值。
　　 結(jié)論:
　　 1.EGFR突變型NSCLC病人灌注參數(shù)BF、BV較野生型者高，可能系突變導(dǎo)致EGFR活性增強，進(jìn)一步導(dǎo)致VEGF產(chǎn)生增多并血管生成增多，而致使代表血流量、血容量的參數(shù)B