麥冬皂苷類成分對NSCLC的體外抑制作用及相關機理研究.pdf

1、非小細胞肺癌(NSCLC)是肺癌的主要類型，約占其75.0％的比例。在NSCLC中，鱗癌與腺癌所占的比例又是最高的，約占80.0％以上。
　　中醫(yī)藥在癌癥的治療中對于穩(wěn)定瘤體、改善癥狀、防止復發(fā)和提高生活質量等方面具有獨到的優(yōu)勢，但其作用機理仍有待進一步闡明，科學化使用程度有待進一步提高。
　　“麥門冬湯合千金葦莖湯”（來自《金匱要略》）及“周氏克金巖方”（來自國醫(yī)大師周仲瑛教授）均為臨床抗肺癌的有效驗方，前期動物實驗研究結

2、果表明，其均能抑制Lewis肺癌及A549、H157肺癌荷瘤小鼠模型體內腫瘤的生長。在這兩張抗肺癌的重要方劑中，麥冬均作為一味不可或缺的中藥組分，課題組前期對其有效部位及活性成分抗非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）的作用進行了細胞水平的高通量篩選，結果表明其皂苷類成分具有顯著的體外抗NSCLC的作用，但其相關機理有待進一步研究。
　　本研究以NSCLC中普遍過度活化的PI3K/Akt

3、/mTOR信號通路為切入點，通過研究麥冬皂苷類細胞毒成分對NSCLC中鱗癌、大細胞癌和腺癌等不同病理分型細胞株的藥理學活性及差異，揭示中藥有效成分抗NSCLC的機理，同時為臨床分子靶向性治療藥物的研究和開發(fā)提供一定的理論基礎。本論文具體開展工作如下:
　　1魯斯可皂苷元(Ruscogenin)、麥冬皂苷B(ophiopogonin B，OP-B)、麥冬皂苷D(ophiopogonin D，OP-D)三種麥冬皂苷體外抗NSCLC活性

4、的初步篩選以肺鱗癌細胞株NCI-H157為研究對象，通過藥物作用后進行細胞周期檢測和對PI3K/Akt/mTOR信號通路進行分析，對三種麥冬皂苷類化合物Ruscogenin、OP-D和OP-B抗NSCLC的藥理學活性進行初步的篩選。結果表明:OP-D各給藥濃度、給藥時間對細胞周期沒有顯著影響;Ruscogenin和OP-B在給藥24 h后導致NCI-H157細胞周期阻滯在G0/G1期;在對PI3K/Akt/mTOR信號通路的作用上，Ru

5、scogenin對整條通路沒有顯著影響，OP-D對該通路下游的eIF4B有顯著激活作用，而OP-B則主要抑制通路上游Akt和p70S6K的磷酸化激活，對下游的eIF4B及eEF2K的磷酸化沒有顯著影響。
　　2 OP-B對肺鱗癌細胞株NCI-H157和大細胞肺癌細胞株H460藥理活性的研究倒置顯微鏡進行形態(tài)學觀察發(fā)現其能誘導這兩種細胞株發(fā)生空泡樣死亡，cleavedCaspase-3、Bcl-2等的Western blot檢測以及

6、Annexin-V/PI/Hoechest33258熒光染色結合高內涵分析發(fā)現該死亡方式不屬于凋亡。自噬金指標LC3-Ⅰ向Ⅱ轉化水平的Western blot檢測結合自噬空泡的電鏡觀察結果證明OP-B在H157和H460細胞株中誘導的均為Ⅱ型程序性死亡，即自噬。通過對調控自噬的關鍵信號通路PI3K/Akt/mTOR的檢測結果發(fā)現OP-B對通路中Akt和p70s6k的磷酸化抑制均呈現時間和劑量依賴關系。通過和PI3K的抑制劑LY29400

7、2以及mTOR抑制劑Rapmycin進行比較，并通過胰島素對信號通路進行給藥后誘導，發(fā)現OP-B對Akt磷酸化的抑制作用較為專一，且是OP-B誘導自噬的原因。
　　3 OP-B對肺腺癌細胞株A549的自噬和凋亡誘導活性研究臨床肺腺癌的發(fā)病率最高，治療最為棘手，在OP-B對肺腺癌細胞株A549的作用中發(fā)現，OP-B通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路，早期誘導細胞自噬，進而誘導其發(fā)生凋亡，而且通過對自噬關鍵蛋白Beclin1的

8、SiRNA干擾實驗證明，自噬是導致細胞凋亡的關鍵因素。
　　4 OP-B對H460和A549細胞周期調控的差異性比較進一步對OP-B在A549和H460細胞株中的周期調控情況進行比較，發(fā)現OP-B在A549中主要通過上調周期抑制蛋白p21和p27的表達和抑制CyclinA2、CDK2、CyclinB1的表達誘導細胞周期阻滯在S和G2/M期;而在H460中，OP-B對周期的調控較弱，主要通過抑制CyclinB1的表達，誘導細胞周期阻

9、滯在G0/G1期。
　　5 OP-B對A549細胞侵襲及遷移的體外研究細胞劃痕實驗和Transwell實驗表明，OP-B在誘導A549細胞凋亡的同時，還抑制細胞的侵襲和遷移。并且對細胞遷移的調控和調節(jié)Akt的磷酸化及EphA2受體的表達有一定關聯。
　　結論
　　在幾種麥冬甾體皂苷類化合物中，二糖苷OP-B為主要的細胞毒成分，其對于不同病理分型的NSCLC細胞株具有不同的藥理學活性。在肺鱗癌和大細胞癌細胞株中，OP-B

10、主要誘導細胞發(fā)生自噬;而在肺腺癌細胞株中，OP-B早期誘導細胞自噬，晚期誘導細胞發(fā)生凋亡。
　　通過對OP-B在三種NSCLC細胞株中作用機制的差異性比較發(fā)現，其主要差別在于對細胞周期的調控上，在H157和H460中主要誘導細胞周期阻滯在G0/G1期，而在A549中則將細胞周期阻滯在S和G2/M期。通過對p-Akt的抑制，OP-B在誘導A549細胞發(fā)生凋亡的同時，還能抑制細胞的侵襲和遷移。在分屬鱗癌、大細胞癌和腺癌三種不同病理亞型