微包埋培養(yǎng)技術的建立及其在粘細菌分離純化中的應用.pdf

1、社會性的粘細菌在生長過程中呈現出聚團生長和細胞密度依賴性等社會性行為。具體表現為，當細胞的接種密度低于105cells/ml時，細胞不能在新的環(huán)境中生長起來，而細胞一旦生長起來，大量的細胞聚集在一起形成一個個緊密的菌團。粘細菌這種協同成長的特性嚴重限制了粘細菌的分離純化工作，如纖維堆囊菌埃博霉素生物合成改造后期突變株的分離純化。
　　 在本文的工作中，我們以SA-CaC12體系為基礎進行包埋條件的優(yōu)化，建立了以1.2％SA為凝膠

2、介質，2％ SrCl2為交聯劑的包埋體系。通過此體系，我們制備得到了為直徑為1.2士0.5 mm的凝膠球粒，其中約80％的凝膠球粒直徑為lmm以內；每毫升SA凝膠可制備1500-2500個球粒。將分散至單細胞狀態(tài)的纖維堆囊菌細胞包埋在海藻酸鍶凝膠球粒中。通過控制單細胞懸液的濃度及凝膠球粒的直徑及數目，實現了對單個纖維堆囊菌細胞的包埋。通過與高濃度、未包埋的纖維堆囊菌細胞共同培養(yǎng)，最終實現了凝膠球粒內單個細胞的生長。含有細胞的凝膠球粒在高

3、濃度磷酸鹽的平板上溶脹后，通過將其轉接到正常的培養(yǎng)基上，實現了對內部細胞的擴大培養(yǎng)，從而獲得了純化的單克隆。應用此方法，我們將預先混合的、同源性為99％的兩株纖維堆囊菌進行分離。隨機挑選的18個凝膠球粒內的細胞經16S rRNA測序證實，球粒內部生長起來的細胞為同種細胞。由此，我們實現了對纖維堆囊菌混合培養(yǎng)物的分離純化。此技術一方面利用海藻酸鹽凝膠介質的交聯結構將細胞限定在一定的空間內，阻斷了纖維堆囊菌細胞生長過程中的粘連聚集；另一方面

4、，通過將包埋有單細胞的凝膠球粒與未包埋的高濃度細胞共同培養(yǎng)，利用凝膠介質形成的交聯網孔允許細胞生長所需要的生長起始因子自由通過的能力，幫助凝膠球粒內極低密度的細胞克服細胞密度依賴性而順利生長增殖。
　　 在建立的微包埋培養(yǎng)技術的基礎上，我們以纖維堆囊菌野生菌株作為助長菌株，對實驗室前期得到的埃博霉素生物合成改造突變株進行包埋純化。隨機挑選4株經包埋培養(yǎng)得到的突變株進行epothilone產量檢測，得到了具備突變株遺傳特性的、埃博

5、霉素產量存在顯著差異的單克隆。該技術克服了纖維堆囊菌突變株傳統(tǒng)分離純化過程中純化效率低下且耗時較長的弊端，將大大加快纖維堆囊菌次級代謝途徑改造的工作進程，提高工作效率。
　　 粘細菌的分離純化通常是利用粘細菌能夠形成子實體的能力進行的。該方法有許多的局限性，例如，單個粘細菌細胞不容易形成菌落；子實體結構不穩(wěn)定，在許多情況下，子實體會退化甚至是丟失；粘細菌的低生長率使得粘細菌很容易受到其它快速生長的細菌和真菌的污染。考慮到這些局限

6、性，我們將建立的微包埋培養(yǎng)技術應用于開發(fā)土壤中溶細菌型粘細菌資源。通過采用不同的粘細菌種屬作為助長菌株，我們對同一土樣進行了四批包埋培養(yǎng)。我們以粘細菌孢囊桿菌亞目特異性探針為篩選手段，以凝膠球粒內生長的粘細菌的16S rRNA基因部分序列(448bp)為基礎繪制系統(tǒng)進化樹。通過進化樹分析，我們從土壤中分離得到了大量溶細菌型粘細菌，這部分粘細菌獨立于課題組之前從該土樣中分離得到的粘細菌。對這部分粘細菌進行人工后續(xù)培養(yǎng)得到了15株粘細菌，對