重組金屬β-內(nèi)酰胺酶的制備及快速檢測試紙的研制.pdf

1、金屬β-內(nèi)酰胺酶（metallo-beta-lactamase簡稱金屬酶、MBLs）是一類需要金屬離子協(xié)助才能發(fā)揮催化活性的一類廣譜β-內(nèi)酰胺酶。它能夠水解β-內(nèi)酰胺類抗生素中的β-內(nèi)酰胺環(huán)，使該類抗生素失去活性。然而目前對于金屬β-內(nèi)酰胺酶的活性測定缺乏有針對性的方法，普遍是借鑒測定青霉素酶酶活的碘量法進(jìn)行測定。
　　目的:建立pET21a/d-CcrA質(zhì)粒在大腸桿菌BL21中的表達(dá)及純化方法，并獲得高純度的金屬β-內(nèi)酰胺酶Ce

2、rA;使用傳統(tǒng)的碘量法測定金屬β-內(nèi)酰胺酶的活性并進(jìn)行評價;使用羥胺法對金屬β-內(nèi)酰胺酶進(jìn)行活性測定，并優(yōu)化反應(yīng)條件;設(shè)計一款操作簡單便捷，結(jié)果準(zhǔn)確直觀的金屬β-內(nèi)酰胺酶快速檢測試紙。
　　方法:將pET21 a/d-CcrA質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21細(xì)菌中，構(gòu)建菌種，而后通過IPTG誘導(dǎo)，對目的蛋白進(jìn)行大量表達(dá)。再使用超聲破碎的方法，透析獲得粗蛋白。粗蛋白經(jīng)過Q-Sepharose柱純化，對收集的餾分用SDS-PAGE進(jìn)行鑒定，

3、合并后超濾獲得高純度的目的蛋白;用傳統(tǒng)碘量法對金屬β-內(nèi)酰胺酶進(jìn)行定量測定，通過對不同批次的產(chǎn)品分別進(jìn)行平行試驗，記錄檢測結(jié)果進(jìn)行比對;用羥胺法對金屬β-內(nèi)酰胺酶進(jìn)行定量測定，分析各個因素對實驗結(jié)果的影響，并最終確定實驗的條件;在羥胺法的基礎(chǔ)上設(shè)計金屬β-內(nèi)酰胺酶快速檢測試紙及相關(guān)的比色卡。
　　結(jié)果:用Q-Sepharose柱純化分離粗蛋金屬β-內(nèi)酰胺酶CcrA的粗蛋白溶液，通過0-0.5MNaCl梯度洗脫，經(jīng)過SDS-PAGE

4、分析鑒定，確定0.3和0.4M洗脫峰純度最高。而后將二者合并并分別用碘量法和羥胺法進(jìn)行測量。通過對結(jié)果的分析比較發(fā)現(xiàn)，碘量法測定的偏差比較大，干擾因素多（實驗過程需要避光，終點判斷依靠個人主觀認(rèn)定等），而且操作麻煩時間長（5h左右），羥胺法相對的時間比較短（1.5h左右），而且干擾因素比較少，結(jié)果重復(fù)性好更為可靠(R2=0.9976)，操作也比較方便，以美羅培南作為底物更有針對性。同時，本次研究還對金屬β-內(nèi)酰胺酶的酶活進(jìn)行了重新定義，

5、能更簡單直觀的反應(yīng)其活性。在羥胺法的基礎(chǔ)上，根據(jù)顯色結(jié)果和酶活之間關(guān)系，設(shè)計了快速檢測試紙和相對應(yīng)的比色卡。進(jìn)一步簡化了操作的過程，為實際生產(chǎn)檢驗提供了幫助。
　　結(jié)論:
　　1、建立了金屬β-內(nèi)酰胺酶CcrA的表達(dá)和純化方法，獲得高純度，活性高的目的蛋白溶液;
　　2、本研究對金屬β-內(nèi)酰胺酶的酶活進(jìn)行了重新定義，新定義更直觀，簡單地反應(yīng)了其作用;
　　3、設(shè)計了金屬β-內(nèi)酰胺酶快速檢測試紙，可以對待測樣品進(jìn)行