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文檔簡介
1、金屬β-內(nèi)酰胺酶(metallo-beta-lactamase簡稱金屬酶、MBLs)是一類需要金屬離子協(xié)助才能發(fā)揮催化活性的一類廣譜β-內(nèi)酰胺酶。它能夠水解β-內(nèi)酰胺類抗生素中的β-內(nèi)酰胺環(huán),使該類抗生素失去活性。然而目前對于金屬β-內(nèi)酰胺酶的活性測定缺乏有針對性的方法,普遍是借鑒測定青霉素酶酶活的碘量法進行測定。
目的:建立pET21a/d-CcrA質(zhì)粒在大腸桿菌BL21中的表達及純化方法,并獲得高純度的金屬β-內(nèi)酰胺酶Ce
2、rA;使用傳統(tǒng)的碘量法測定金屬β-內(nèi)酰胺酶的活性并進行評價;使用羥胺法對金屬β-內(nèi)酰胺酶進行活性測定,并優(yōu)化反應條件;設(shè)計一款操作簡單便捷,結(jié)果準確直觀的金屬β-內(nèi)酰胺酶快速檢測試紙。
方法:將pET21 a/d-CcrA質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21細菌中,構(gòu)建菌種,而后通過IPTG誘導,對目的蛋白進行大量表達。再使用超聲破碎的方法,透析獲得粗蛋白。粗蛋白經(jīng)過Q-Sepharose柱純化,對收集的餾分用SDS-PAGE進行鑒定,
3、合并后超濾獲得高純度的目的蛋白;用傳統(tǒng)碘量法對金屬β-內(nèi)酰胺酶進行定量測定,通過對不同批次的產(chǎn)品分別進行平行試驗,記錄檢測結(jié)果進行比對;用羥胺法對金屬β-內(nèi)酰胺酶進行定量測定,分析各個因素對實驗結(jié)果的影響,并最終確定實驗的條件;在羥胺法的基礎(chǔ)上設(shè)計金屬β-內(nèi)酰胺酶快速檢測試紙及相關(guān)的比色卡。
結(jié)果:用Q-Sepharose柱純化分離粗蛋金屬β-內(nèi)酰胺酶CcrA的粗蛋白溶液,通過0-0.5MNaCl梯度洗脫,經(jīng)過SDS-PAGE
4、分析鑒定,確定0.3和0.4M洗脫峰純度最高。而后將二者合并并分別用碘量法和羥胺法進行測量。通過對結(jié)果的分析比較發(fā)現(xiàn),碘量法測定的偏差比較大,干擾因素多(實驗過程需要避光,終點判斷依靠個人主觀認定等),而且操作麻煩時間長(5h左右),羥胺法相對的時間比較短(1.5h左右),而且干擾因素比較少,結(jié)果重復性好更為可靠(R2=0.9976),操作也比較方便,以美羅培南作為底物更有針對性。同時,本次研究還對金屬β-內(nèi)酰胺酶的酶活進行了重新定義,
5、能更簡單直觀的反應其活性。在羥胺法的基礎(chǔ)上,根據(jù)顯色結(jié)果和酶活之間關(guān)系,設(shè)計了快速檢測試紙和相對應的比色卡。進一步簡化了操作的過程,為實際生產(chǎn)檢驗提供了幫助。
結(jié)論:
1、建立了金屬β-內(nèi)酰胺酶CcrA的表達和純化方法,獲得高純度,活性高的目的蛋白溶液;
2、本研究對金屬β-內(nèi)酰胺酶的酶活進行了重新定義,新定義更直觀,簡單地反應了其作用;
3、設(shè)計了金屬β-內(nèi)酰胺酶快速檢測試紙,可以對待測樣品進行
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