天山凍土產(chǎn)低溫β-半乳糖苷酶菌株篩選、純化及酶學(xué)性質(zhì)初步研究.pdf

1、目的：β-半乳糖苷酶是一種非常重要的工業(yè)用酶，已被廣泛應(yīng)用在食品、制藥和生物技術(shù)等行業(yè)的各個(gè)方面。低溫β-半乳糖苷酶是由低溫微生物產(chǎn)生的，篩選低溫β-半乳糖苷酶菌株是解決酶來(lái)源最關(guān)鍵的問題。天山凍土中含有豐富的低溫微生物的資源，本文通過(guò)對(duì)天山凍土中產(chǎn)低溫β-半乳糖苷酶菌株的分離和純化，詳細(xì)分析了產(chǎn)酶菌株的系統(tǒng)發(fā)育、生理多樣性和耐藥性，對(duì)β-半乳糖苷酶的粗酶液酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了初步研究，為低溫β-半乳糖苷酶的在食品加工業(yè)的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

2、>　　方法：本研究以乳糖為主要碳源，X-Gal為顯色劑，從天山1號(hào)冰川中分離篩選出產(chǎn)低溫β-半乳糖苷酶菌株。對(duì)產(chǎn)酶菌株進(jìn)行了常規(guī)生理生化實(shí)驗(yàn)、并對(duì)最適生長(zhǎng)溫度和耐鹽性進(jìn)行了測(cè)定。先根據(jù)16SrRNA的基因序列對(duì)產(chǎn)低溫β-半乳糖苷酶菌種的系統(tǒng)進(jìn)化地位進(jìn)行初步確定，再通過(guò)BOX-PCR指紋圖譜技術(shù)對(duì)16SrRNA基因高度同源性的產(chǎn)酶菌株進(jìn)一步區(qū)分。此外，采用紙片法對(duì)產(chǎn)低溫β-半乳糖苷酶菌株的耐藥性進(jìn)行了初步分析，并對(duì)粗酶液的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研

3、究。
　　結(jié)論：
　　1．從天山凍土中共篩選出25株產(chǎn)低溫β-半乳糖苷酶菌株，均能在含有X-Gal中的TSB瓊脂平板上產(chǎn)生藍(lán)色菌落。所有產(chǎn)酶菌株均為桿菌，大部分呈乳白色，有部分透明。有些菌株比較類外，如m12-1的菌落為土黃色。革蘭氏染色結(jié)果顯示25株產(chǎn)酶菌株中陽(yáng)性菌為76％，其余全為陰性菌。耐鹽性試驗(yàn)結(jié)果顯示有76%的產(chǎn)酶菌株，其最高耐鹽濃度為6%，而有些菌株耐鹽性很差，如菌株A35的最高耐鹽濃度僅為4%左右，還有一些菌株

4、如m12-1在鹽濃度為8%時(shí)仍可生長(zhǎng)，但是當(dāng)鹽濃度高于12%時(shí)，則生長(zhǎng)十分緩慢甚至停止生長(zhǎng)。80%的產(chǎn)酶菌株其最高生長(zhǎng)溫度是24℃，而最適生長(zhǎng)溫度是15℃。
　　2．依據(jù)生長(zhǎng)溫度，產(chǎn)酶菌株有80%為嗜冷菌，其余均為耐冷菌。在系統(tǒng)發(fā)育上，屬于α變形細(xì)菌亞綱（Alpha-Proteobacteria）和γ變形細(xì)菌亞綱（Gamma-Proteobacteria）的菌株各有6株、屬于β變形細(xì)菌亞綱（Beta-Proteobacteria）

5、有2株、而屬于厚壁菌門（Firmicutes）有7株，顯然厚壁菌門（Firmicutes）菌屬為優(yōu)勢(shì)菌屬所占比重最大，對(duì)凍土中產(chǎn)低溫β-半乳糖苷酶菌株的多樣性貢獻(xiàn)最多，其次是α變形細(xì)菌亞綱(Alpha-Proteobacteria)和γ變形細(xì)菌亞綱(Gamma-Proteobacteria)，而β變形細(xì)菌亞綱(Beta-Proteobacteria)是數(shù)量最少的。25株產(chǎn)酶菌株中腸球菌屬（Enterococcus）最多為26%，短波單胞

6、菌屬（Brevundimonas）次之，假單胞菌屬(Pseudomonas)最少為13%。
　　3．生理生化試驗(yàn)表明在吲哚試驗(yàn)和明膠水解試驗(yàn)中顯示為陽(yáng)性的菌株分別為93.1%和13.8%。同時(shí)所有的產(chǎn)酶菌株都能以鼠李糖、甘露糖和山梨糖為碳源生長(zhǎng)，菌株所占比例最高，果糖次之，蔗糖最少。另外，能利用甘露醇的菌株比例要高于山梨醇，能利用草酸鹽的菌株比例要高于苯甲酸鹽，這說(shuō)明菌株對(duì)同類碳源的利用有差異性。
　　4．所有的產(chǎn)酶菌株均對(duì)

7、桿菌肽產(chǎn)生耐藥性，對(duì)卡那霉素產(chǎn)生耐藥性的菌株比例與對(duì)其產(chǎn)生中度敏感的比例相同。而對(duì)氯霉素、鏈霉素、紅霉素、四環(huán)素、卡那霉素和去甲萬(wàn)古霉素產(chǎn)生耐藥性的菌株比例明顯低于對(duì)其敏感的菌株比例；對(duì)桿菌肽、利福平、青霉素、氨芐西林和頭孢氨噻肟產(chǎn)生耐藥性的菌株比例明顯高于對(duì)其敏感的菌株比例，并且產(chǎn)酶菌株都對(duì)慶大霉素敏感。
　　5．酶學(xué)初步研究結(jié)果表明：菌株R60產(chǎn)的低溫β-半乳糖苷酶的最適反應(yīng)溫度為30℃，最適pH值為6.5。此外，Mn2+、M