特異腐質霉H31-3纖維二糖水解酶基因克隆與表達.pdf

1、目的:纖維素是地球上數量最多的可再生資源。它具有穩(wěn)定的化學結構,不易被降解。隨著糧食短缺,能源危機和環(huán)境污染的日益嚴重,如何合理的利用現存的大量的纖維素供能,成為人們關注的問題。
　　 纖維素酶是一種催化纖維素分解的酶。用纖維素酶分解纖維素具有高效、方便、副產品少等優(yōu)勢,成為研究的熱點。研究發(fā)現很多生物都產生纖維素酶,如細菌、放線菌、真菌、昆蟲等。其中真菌因產生的纖維素酶種類多,活力高而受到人們的關注。維素酶分為三種類型:內切葡

2、萄糖苷酶(EG),纖維二糖水解酶(CBH),β-葡萄糖苷酶(BG)。
　　 國內纖維素酶的產量較低,大部分需要進口。人們利用多種方法來提高纖維素酶的產量和活力。傳統的菌種選育和幾種酶的混合搭配,對酶的催化作用提高不大。將基因工程的方法應用于酶學領域,對纖維素酶的研究向前推進一步。例如:人們用活性位點突變的方法,改變酶蛋白的折疊,來提高酶的活性。人們也將纖維素酶的基因轉入到工程菌中進行表達,以提高它的產量。目前使用的工程菌有很多,

3、如大腸桿菌、釀酒酵母菌、畢赤酵母菌等等。其中,畢赤酵母菌表達真核蛋白具有產量高、易培養(yǎng)、對蛋白的修飾與真核生物相似等獨特的優(yōu)點而被廣泛的應用。
　　 中科院微生物所在1970年從腐殖土里分離得到了一株特異腐質霉H31-3。該菌產生的中性纖維素酶耐高溫,且有較廣的PH值穩(wěn)定性,非常適用于工業(yè)生產。石家驥老師等,對該菌進行了突變,使它的產酶量和活力進一步提高。該實驗室將突變后特異腐質霉產生的三種主要的纖維素酶進行了純化和質譜分析。質

4、譜結果顯示,突變后的特異腐質霉分泌cbh2蛋白與灰色腐質酶熱變種產生的纖維二糖水解酶O93780具有相同的氨基酸序列。由于,真菌產生的纖維素酶基因的同源性較高,在纖維素酶催化區(qū)和纖維素結合區(qū)的核苷酸序列保守性很強。不能僅由質譜結果確定這兩個蛋白相同。另外,具有相同氨基酸的蛋白,如果來自于不同的菌株,可能會有不同的基因型.因此,為了對cbh2進行開發(fā),首先要確定突變后特意腐質霉cbh2的基因,再將cbh2表達,獲得大量的分泌型cbh2蛋白

5、。本實驗的目的是確定特異腐質酶H31-3 cbh2的基因,再將其轉入畢赤酵母菌中進行表達和分泌。
　　 方法:
　　 1.確定特突變后異腐質霉的H31-3cbh2基因序列
　　 1.1部分cbb.2基因片段的克隆
　　 先提突變后的特意腐質霉基因組DNA,依據cbh2的質譜結果中與O93780相似的氨基酸序列設計引物P1和P2。擴增出長約500bp的基因片段。膠回收、測序,用BLAST軟件與報道的O937

6、80基因比對。測序結果與O93780的部分基因片段相同。
　　 1.2 cbh2基因全長的克隆并與O93780基因進行比對
　　 依據報道的O93780全基因序列設計引物P3和P4,擴增出長約1500bp的基因片段。膠回收,連接到pEASY-T載體上,將該重組產物轉入大腸感受態(tài)中擴增。用含有青霉素的LB平板篩選陽性轉化子,將長出的轉化子小量培養(yǎng),提質粒,用P3和P4引物進行PCR驗證,將驗證為陽性的質粒測序。測序結果與O

7、93780的全基因序列比對。比對結果顯示,測序結果與O93780全的基因序列完全相符。
　　 2.構建兩種分泌型的表達載體,一是帶有載體自身信號肽的pGAPZαA-cbh2 cDNA,一是帶有cbh2蛋白自身信號肽的pGAPZA-cbh2 cDNA2
　　 2.1特異腐質霉總RNA的提取
　　 2.2無蛋白自身信號肽的cbb2 cDNA和帶自身信號肽的cbh2 cDNA2的克隆
　　 依據NCBI報道的O

8、93780去信號肽的基因序列,設計引物P5和P6,其中P5去掉O93780前面的24個氨基酸信號肽,并加上EcoR1酶切位點及保護性堿基。P6加上Not1酶切位點和保護性堿基。用RT-PCR的方法得到了去掉信號肽的cbh2 cDNA。帶有信號肽的cbh2 cDNA2用P7和P6為引物,用RT-PCR的方法合成。
　　 2.3將重組載體pEASY-T-cbh2 cDNA和pEASY-T-cbb.2 cDNA2轉入大腸感受態(tài)中進行擴

9、增
　　 將上述RT-PCR產物膠回收與pEASY-T連接,形成重組質粒pEASY-T-cbh2 cDNA和pEASY-T-cbh2 cDNA2,將上述兩種重組質粒用化學方法轉入大腸桿菌中。用含有青霉素的LB培養(yǎng)基篩選陽性轉化子,將長出的轉化子進行小量培養(yǎng),分別用兩對引物P7、P6和P5、P6,進行PCR,鑒定cbh2 cDNA和cbh2 cDNA2,將鑒定為陽性的質粒測序。測序結果與O93780的基因序列比對,確定兩種cbh2

10、 cDNA的擴增的正確性。
　　 2.4構建兩種分泌型的重組質粒并轉入大腸感受態(tài)中擴增
　　 分別將測序正確的cbh2 cDNA、cbh2 cDNA2與pGAPZaA和pGAPZA載體用EcoR1和Not1雙酶切,連接,以化學轉化的方法將該重組質粒轉入大腸感受態(tài)中擴增。用帶有Zeocin抗性的LB平板篩菌。將長出的轉化子進行小量培養(yǎng),提質粒,用兩對引物(P5和P6;P7和P6)進行PCR驗證,將驗證為陽性的質粒送去測序,

11、測序引物為a-factor和3-AOX。將
　　 2個測序結果與O93780 cDNA核苷酸序列比對,確定cbh2 cDNA和cbh2cDNA2在表達載體pGAPZA和pGAPZaA中的插入是否正確。
　　 3將重組正確的pGAPZaA-cbh2 cDNA與pGAPZA-cbh2 cDNA2轉入畢赤酵母菌中進行分泌
　　 3.1制備畢赤酵母感受態(tài)細胞
　　 3.2將重組質粒pGAPZaA-cbh2 cDN

12、A與pGAPZA-cbh2 cDNA2用BspH1線性化
　　 3.3將上述線性化產物以電轉化的方法轉入畢赤酵母感受態(tài)細胞中,用含有Zeocin抗性的YPD平板進行篩選。將轉化子用YPD培養(yǎng)基進行培養(yǎng),提畢赤酵母的基因組DNA,用兩對P5和P6;P7和P6,以PCR的方法來驗證cbh2 cDNA及cbh2 cDNA2是否整合到畢赤酵母基因組染色體上。并以a-factor和3-AOX為引物測序驗證整合是否正確。
　　 3.

13、4驗證cbh2蛋白分泌
　　 將整合有外源基因的畢赤酵母在YPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時,收集上清粗酶液,用SDS-PAGE方法確定粗酶液中是否有特異的蛋白條帶產生,觀察特異性條帶的大小,并將特異性條帶切下來,做質譜分析。
　　 3.5測定畢赤酵母中分泌的上述cbh2蛋白的最適溫度,最適PH和溫度穩(wěn)定性
　　 4.用甲醇誘導畢赤酵母菌cbh2的表達
　　 將整合有pGAPZaA-cbh2 cDNA的畢赤酵母菌

14、接種于BMGY培養(yǎng)基中生長至菌密度OD600=3,收集菌體轉接于BMMY培養(yǎng)集中,用1％甲醇誘導表達,測定分泌蛋白的活性。
　　 結果:
　　 1突變特異腐質霉cbh2與灰色腐質霉熱變種O93780有相同的核苷酸序列,這兩種蛋白具有相同的基因。
　　 2成功在畢赤酵母菌中表達了特變特意腐質霉分子量為55KD的H31-3cbh2
　　 3蛋白自身的信號肽不能將cbh2分泌到胞外,載體的信號肽可以將cbh2蛋

15、白分泌到胞外。在BMMY培養(yǎng)基中,用1％的甲醇誘導cbh2蛋白表達失敗。
　　 4畢赤酵母菌分泌的cbh2蛋白其最適PH值為8,最適溫度為70℃。在50℃保存12小時后,酶活依舊有65％。
　　 結論:
　　 1突變特異腐質霉(H31-3)cbh2與灰色腐質霉熱變種O93780有相同基因。
　　 2在畢赤酵母菌中表達了最適PH為8,最適溫度為70℃,分子量為55KD的可分泌的突變特異腐質霉H31-3 cb