新型工業(yè)絮凝酵母的構(gòu)建與乙醇耐性研究.pdf

1、絮凝是工業(yè)釀酒酵母的重要特征，利用絮凝分離菌體，替代離心分離，可顯著降低菌體分離成本，但國內(nèi)外研究較多的組成型絮凝對生長有抑制作用，如果使用誘導(dǎo)型絮凝菌株，在發(fā)酵前期保持游離狀態(tài)，而發(fā)酵結(jié)束后開始絮凝沉降，既能保證細(xì)胞通過自沉降采收，又可減輕組成型絮凝帶來的內(nèi)擴(kuò)散效應(yīng)。此外，選育脅迫耐受性提高的工業(yè)釀酒酵母菌株，可以使其在高濃度乙醇等脅迫條件下具有良好的活性，從而提高發(fā)酵終點(diǎn)的乙醇濃度，節(jié)省下游過程如乙醇精餾和廢糟液處理等的能耗。本論文

2、的主要研究目的是構(gòu)建新型誘導(dǎo)絮凝的工業(yè)釀酒酵母，并尋找關(guān)鍵的乙醇耐性相關(guān)基因，為選育高效乙醇發(fā)酵工業(yè)酵母奠定基礎(chǔ)。
　　酵母的絮凝表型可以通過表達(dá)絮凝基因來獲得。本文克隆了來源于自絮凝酵母SPSC01的絮凝基因FLO1，并將其整合到工業(yè)釀酒酵母菌株Sc4126染色體上，通過SPSC01中克隆的海藻糖6-磷酸合酶TPS1啟動(dòng)子調(diào)控其表達(dá)，從而構(gòu)建了遺傳穩(wěn)定的誘導(dǎo)型絮凝酵母，其絮凝性狀可以響應(yīng)乙醇濃度變化，在發(fā)酵前期乙醇濃度較低時(shí)絮凝

3、較弱，因此保證酵母細(xì)胞能良好生長，在發(fā)酵后期乙醇濃度高時(shí)絮凝增強(qiáng)，從而實(shí)現(xiàn)發(fā)酵結(jié)束后酵母自沉降采收。所構(gòu)建的誘導(dǎo)型絮凝酵母的乙醇發(fā)酵性能與組成型絮凝酵母相比顯著改善，其生長和發(fā)酵接近游離酵母宿主。進(jìn)一步通過模式菌株S288c來源的TPS1啟動(dòng)子對絮凝性狀實(shí)現(xiàn)精細(xì)調(diào)控，由于模式酵母S288c的TPS1啟動(dòng)子脅迫響應(yīng)原件STRE個(gè)數(shù)比SPSC01中克隆的TPS1啟動(dòng)子少，所構(gòu)建的絮凝酵母對乙醇的響應(yīng)得以弱化，延遲了絮凝的發(fā)生并降低了絮凝強(qiáng)度

4、，從而進(jìn)一步提高了發(fā)酵效率，而且在發(fā)酵終點(diǎn)酵母可以完全沉降實(shí)現(xiàn)菌體與產(chǎn)物的自動(dòng)分離。
　　酵母細(xì)胞的乙醇耐受性由多基因調(diào)控，改造轉(zhuǎn)錄因子是提高酵母細(xì)胞乙醇耐受性的有效策略。前期研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中添加鋅離子可以顯著提高酵母細(xì)胞的乙醇耐性。因此進(jìn)一步深入研究了鋅離子提高酵母細(xì)胞乙醇耐性的機(jī)理，從而尋找關(guān)鍵的代謝調(diào)控基因進(jìn)行耐性菌株的構(gòu)建。利用150 g/L葡萄糖的培養(yǎng)基進(jìn)行乙醇連續(xù)發(fā)酵，在培養(yǎng)基中添加0.05 g/L的硫酸鋅后，酵母細(xì)

5、胞的乙醇耐受性提高，乙酸和丙酮酸等副產(chǎn)物及胞內(nèi)活性氧水平下降，絮凝性也下降，但細(xì)胞的氮和麥角固醇含量提高。轉(zhuǎn)錄組與蛋白組分析共檢測到330個(gè)轉(zhuǎn)錄表達(dá)差異基因和71個(gè)蛋白表達(dá)差異基因，表明鋅離子可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞全局基因表達(dá)水平對代謝產(chǎn)生影響。轉(zhuǎn)錄組分析和蛋白組分析結(jié)果不完全一致，說明存在大量轉(zhuǎn)錄與翻譯水平不一致的情況，推測鋅對細(xì)胞代謝的調(diào)控存在轉(zhuǎn)錄和翻譯后水平的修飾。受鋅離子調(diào)控的主要代謝通路包括核糖體合成、糖酵解與乙醇生成、磷脂與麥角固

6、醇合成、ROS響應(yīng)及相關(guān)的氧化還原系統(tǒng)、細(xì)胞絮凝、胞內(nèi)鋅離子平衡及轉(zhuǎn)錄因子激活或抑制等?？梢钥紤]選取這些途徑中的相關(guān)酶和差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子作為后續(xù)乙醇耐性改造的靶點(diǎn)。還發(fā)現(xiàn)了94個(gè)功能未知的基因響應(yīng)鋅離子的添加，為進(jìn)一步探討鋅離子提高酵母菌乙醇耐性的機(jī)理，并對關(guān)鍵的調(diào)控基因進(jìn)行代謝工程改造奠定了基礎(chǔ)。最后利用人工鋅指蛋白技術(shù)進(jìn)行了基因組工程改造，證明人工轉(zhuǎn)錄因子技術(shù)可以有效選育乙醇耐性提高的工業(yè)釀酒酵母。本論文的研究為進(jìn)一步選育高效乙醇