泛素-26S蛋白酶體途徑對(duì)寄主和非寄主抗性的調(diào)控功能分析.pdf

1、泛素是一個(gè)由76個(gè)氨基酸組成的高度保守的小分子蛋白，因廣泛存在于各種真核生物細(xì)胞中而得名。泛素化是一種蛋白質(zhì)翻譯后修飾(post-translationalmodifications，PTM)，與蛋白質(zhì)磷酸化信號(hào)傳導(dǎo)作用相似，其在細(xì)胞生命活動(dòng)的許多進(jìn)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，比如涉及內(nèi)吞作用、組蛋白活性和DNA修復(fù)等過(guò)程。泛素化的蛋白通過(guò)26S蛋白酶體進(jìn)行降解。泛素-26S蛋白酶體途徑是植物中高效專(zhuān)一蛋白降解調(diào)控機(jī)制之一，幾乎參與植物生

2、命活動(dòng)的各個(gè)環(huán)節(jié)。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)泛素化系統(tǒng)與人類(lèi)疾病密切相關(guān)，但是關(guān)于植物泛素化蛋白與植物抗病性的研究較少。本研究利用VIGS技術(shù)分析了2個(gè)泛素-26S蛋白酶體途徑相關(guān)基因在植物抗病中的作用，同時(shí)運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，研究了本氏煙對(duì)水稻白葉枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae，Xoo)非寄主抗性表現(xiàn)與不表現(xiàn)時(shí)的蛋白差異表達(dá)情況，鑒定了表現(xiàn)該非寄主抗性時(shí)的泛素化蛋白。獲得了以下結(jié)果：
　　 (1)采用

3、VIGS技術(shù)分析了泛素融合降解蛋白(ubiquitin fusion protein，18-8)基因?qū)χ参锟共『涂鼓嫘缘恼{(diào)控功能。發(fā)現(xiàn)18-8沉默植株產(chǎn)生的Cf-4/Avr4和Cf-9/Avr9介導(dǎo)產(chǎn)生的過(guò)敏性反應(yīng)(hypersensitive response，HR)癥狀比對(duì)照顯著減輕。18-8沉默植株產(chǎn)生的水稻白葉枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae，Xoo)誘導(dǎo)的HR癥狀也比對(duì)照顯著減輕。在沉默植株葉片

4、上接種煙草野火病菌(Pseudomonas syringae pv.tabaci，Pst)和核盤(pán)菌(Sclerotinia sclerotiorum，Ss)后推遲產(chǎn)生并表現(xiàn)更輕的病害癥狀。高鹽脅迫下，18-8沉默植株的葉片的葉綠素降解比對(duì)照明顯增強(qiáng)。這些研究結(jié)果表明，18-8基因是植物抗病和抗逆性重要調(diào)控因子。它可能對(duì)Xoo介導(dǎo)的HR和耐鹽性起正向調(diào)控作用，而對(duì)Pst和Ss的抗病性起負(fù)調(diào)控作用。
　　 (2)通過(guò)VIGS技術(shù)研究

5、了泛素羧端水解酶(ubiquitin carboxyl-terminalhydrolase，18-5)的基因功能，研究發(fā)現(xiàn)80％沉默植株與CK產(chǎn)生了一樣強(qiáng)烈的Cf介導(dǎo)的HR反應(yīng)。18-5沉默植株產(chǎn)生更弱的Xoo誘導(dǎo)的HR和更早更強(qiáng)的干旱萎蔫癥狀。Ss對(duì)沉默植株的侵染情況與CK相似。高鹽脅迫下，18-5沉默植株的葉片的葉綠素降解比對(duì)照明顯增強(qiáng)。。這些研究結(jié)果表明，18-5可能參與水稻白葉枯病菌介導(dǎo)的非寄主抗性、耐鹽、抗旱等調(diào)控。
　

6、　 (3)開(kāi)展了本氏煙對(duì)Xoo的非寄主抗性蛋白質(zhì)組學(xué)分析。通過(guò)雙向電泳分析，分別獲取了MG132處理和MG132+Xoo處理的煙草葉片組織蛋白質(zhì)圖譜。兩種處理的蛋白質(zhì)圖譜的比較分析表明，蛋白質(zhì)豐度變化在2倍以上的差異蛋白點(diǎn)有45個(gè)，通過(guò)MALDI-TOF-TOF-MS質(zhì)譜分析成功鑒定了其中36個(gè)。其中8/9(32個(gè))在MG132+Xoo處理中表達(dá)下調(diào)，1/9(4個(gè))表達(dá)上調(diào)。這些差異表達(dá)蛋白主要涉及代謝(25％)、光合作用(25％)、

7、生物合成(氨基酸合成10％、蛋白合成3％和維生素合成3％)、防衛(wèi)相關(guān)蛋白(12％)、蛋白降解(5％)、細(xì)胞骨架(2％)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)(2％)、信號(hào)傳導(dǎo)(5％)、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)(2％)、核質(zhì)運(yùn)輸(2％)、轉(zhuǎn)錄后的基因表達(dá)調(diào)控(2％)，另外有2％蛋白功能未知。
　　 (4)采用免疫親和色譜以及色質(zhì)聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行了表現(xiàn)Xoo誘導(dǎo)的非寄主抗性時(shí)的本氏煙植株中的泛素化蛋白。利用泛素抗體柱，通過(guò)親和色譜富集和純化泛素化蛋白，然后采用液向色譜與納升級(jí)質(zhì)聯(lián)