嗜熱真菌脂肪酶基因的克隆、表達及定向進化.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、易錯PCR方法,建立了含有9654個轉化子的突變體庫。通過三丁酸甘油酯平板透明圈法、小量發(fā)酵和大量發(fā)酵法篩選突變體庫。最終獲得9個突變菌株,經發(fā)酵酶活測定發(fā)現(xiàn)酶活最高提高到原始菌株的1.24倍,沒有達到預期的效果。同時利用易錯PCR方法對疏綿狀嗜熱絲孢菌(Thermomyces lanuginosus)脂肪酶LN進行定向進化。采用易錯PCR方法,建立了含有11736個轉化子的突變體庫。通過篩選,最終獲得2株酶活力分別是野生菌酶活力3.4

2、倍和2.2倍的突變體菌株:GS-LN4和GS-LN11。對突變體菌株測序并與野生菌株基因比較發(fā)現(xiàn),GS-LN4中有4個堿基發(fā)生改變,其中2個位點引起氨基酸變化,它們是A96V,Q132R;GS-LN11中基有7個堿基發(fā)生變化,其中引起7個氨基酸變化,分別是E16D,D50V,L98F,R130K,F(xiàn)147Y,N231D,T236S。對這兩個工程菌株進行發(fā)酵,通過硫酸銨沉淀、DEAE-Sepharose陰離子交換柱層析等步驟,得到了純化的

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