嗜熱真菌脂肪酶基因的克隆、表達(dá)及定向進(jìn)化.pdf_第1頁(yè)
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1、易錯(cuò)PCR方法，建立了含有9654個(gè)轉(zhuǎn)化子的突變體庫(kù)。通過(guò)三丁酸甘油酯平板透明圈法、小量發(fā)酵和大量發(fā)酵法篩選突變體庫(kù)。最終獲得9個(gè)突變菌株，經(jīng)發(fā)酵酶活測(cè)定發(fā)現(xiàn)酶活最高提高到原始菌株的1.24倍，沒(méi)有達(dá)到預(yù)期的效果。同時(shí)利用易錯(cuò)PCR方法對(duì)疏綿狀嗜熱絲孢菌（Thermomyces lanuginosus）脂肪酶LN進(jìn)行定向進(jìn)化。采用易錯(cuò)PCR方法，建立了含有11736個(gè)轉(zhuǎn)化子的突變體庫(kù)。通過(guò)篩選，最終獲得2株酶活力分別是野生菌酶活力3.4

2、倍和2.2倍的突變體菌株:GS-LN4和GS-LN11。對(duì)突變體菌株測(cè)序并與野生菌株基因比較發(fā)現(xiàn)，GS-LN4中有4個(gè)堿基發(fā)生改變，其中2個(gè)位點(diǎn)引起氨基酸變化，它們是A96V，Q132R;GS-LN11中基有7個(gè)堿基發(fā)生變化，其中引起7個(gè)氨基酸變化，分別是E16D，D50V，L98F，R130K，F(xiàn)147Y，N231D，T236S。對(duì)這兩個(gè)工程菌株進(jìn)行發(fā)酵，通過(guò)硫酸銨沉淀、DEAE-Sepharose陰離子交換柱層析等步驟，得到了純化的

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