水解進程對乳蛋白酶解產物抗菌性能的影響研究.pdf

1、生物活性肽是指對生命活動具有調節(jié)作用的多肽，通常以多肽鏈序列的形式存在于蛋白質之中。利用天然的蛋白質作為原料，使用蛋白酶水解制取各種生物活性肽，是生物活性肽制備技術中最具可行性的一種。使用酶解法制取生物活性肽，有間歇式水解和酶膜生物反應器中連續(xù)水解兩種手段，前者自動化程度低，操作簡便，后者可以連續(xù)運行，生產效率高。
　　 抗菌肽是生物活性肽家族中的一員，它是生物體抵抗外來微生物侵襲的重要手段，通過破壞細胞膜結構、誘導細胞凋亡、抑

2、制細胞呼吸和DNA合成等機制來達到抑菌作用。從制備抗菌肽的天然蛋白質的來源上講，乳蛋白是制備抗菌肽的重要原料。乳蛋白中的乳酪蛋白、乳清蛋白和乳鐵蛋白，它們的水解產物對微生物的影響存在差異。本論文的研究，主要分為以下幾個部分：第一是探索了乳蛋白的分離與檢測技術，優(yōu)化分離工藝，提出了新的乳鐵蛋白的檢測方法；第二是在間歇式反應條件下，對不同類型的乳蛋白進行酶解，優(yōu)化酶解反應條件，測定水解產物的抗菌特性；第三是嘗試在酶膜反應器中連續(xù)水解乳蛋白制

3、備抗菌肽。
　　 論文首先以脫脂乳粉作為原料，通過控制等電點的手段制備酪蛋白，得率可以達到7.8％。除去酪蛋白后的乳清，在中性條件下經過10K的超濾膜處理，可以脫去其中的乳糖和鹽分，成為高純度的乳清分離蛋白。
　　 論文提出了一種借助高效液相色譜測定乳制品中乳鐵蛋白的方法。先通過額外加入的亞鐵離子使乳鐵蛋白的構型更加穩(wěn)定。然后用60％乙醇沉淀蛋白除去糖分，再用醋酸鹽緩沖液提取乳鐵蛋白并分離掉酪蛋白，最后用高效液相色譜檢測

4、。采用LiChrosorb RP-C18色譜柱，在0.1％三氟乙酸協(xié)助下，甲醇與水線性梯度洗脫。乳鐵蛋白的線性范圍是0.4～2mg/mL(R2=0.9980)，平均回收率95.4％?？梢杂糜谝话闳橹破分腥殍F蛋白的測定。
　　 此外，一種借助乳鐵蛋白鐵結合能力測定奶粉中乳鐵蛋白的方法也被提出并與HPLC的檢測結果進行比較。先通過額外加入的亞鐵離子使乳鐵蛋白中的鐵達到飽和以獲得穩(wěn)定的鐵含量，然后對蛋白反復醇沉和水溶以除去游離鐵，再用

5、原子吸收分光光度計測定鐵含量，依據鐵與蛋白含量的相互關系計算出乳鐵蛋白含量。該法快速準確，加樣回收率超過96％，檢測范圍為3.5～100mg/g。該法可以用于嬰兒配方奶粉中乳鐵蛋白的測定。
　　 以牛初乳作為原料，經等電點沉淀和加壓過濾除去酪蛋白，隨后在pH7.5條件下加入乙醇至50％，可以使乳清中的乳鐵蛋白沉淀并獲得粗制品，粗制品經低壓液相色譜純化以及切向流超濾脫鹽后可以獲得高純度的乳鐵蛋白，該乳鐵蛋白制品經HPLC和HPEC

6、分析，雜質含量均已低于檢測限度。
　　 在乳鐵蛋白水解工藝的優(yōu)化過程中，使用平行試驗法設計實驗，借助Mathematic7.01軟件實施曲面回歸分析初步得出，當以蛋白質水解程度最大為目標時，胃蛋白酶水解乳鐵蛋白反應體系適宜的條件是：底物濃度2％，溫度37℃，pH2.2-2.3，酶用量7U/g.當水解反應進行到60min時，所得水解產物抑菌活力最強。
　　 在乳清蛋白水解工藝的優(yōu)化過程中，使用SPSS18.0軟件設計正交實

7、驗方案，并進行單變量一般線性模型的方差分析。使用堿性蛋白酶水解乳清蛋白適宜的工藝參數為：酶底比5％，pH8.0，溫度45℃。水解產物不對病原微生物產生抑制作用，但可以促進益生菌的生長。
　　 將胰蛋白酶和中性蛋白酶以1:1的比例復合使用來水解酪蛋白。使用DesignExpert軟件的Box-Behken模塊中的響應面分析法設計實驗方案并作回歸分析，發(fā)現在pH7.4，溫度44℃，底物濃度32g/L，酶底比2.5％下，水解90min