鎘抗性細菌Cupriavidus campinensis KQ46的分離鑒定及其鎘抗性機制研究.pdf

1、隨著經(jīng)濟發(fā)展，重金屬鎘污染的問題日益嚴重，不斷威脅著生態(tài)環(huán)境和人類健康。微生物在鎘污染修復和治理中具有巨大的應用價值，而微生物鎘抗性的高低是其應用范圍的一個決定性因素，研究微生物的鎘抗性機制可以為微生物更好應用于鎘污染治理與修復提供理論支持。
　　從南京市棲霞山鉛鋅礦區(qū)的鎘污染土壤及其附近生長的鎘超富集植物龍葵中共分離到72株鎘抗性細菌，其中34株分離自土壤，20株分離自龍葵根部，18株分離自龍葵莖。測定了菌株對鎘的最大耐受濃度(

2、MTC)和抗生素抗性，并對菌株的16SrDNA序列進行了測定和比對，發(fā)現(xiàn)菌株KQ46可以耐受的Cd2+濃度為4mM，對卡那霉素和慶大霉素敏感，確定以菌株KQ46為尋找鎘抗性相關基因的出發(fā)菌株。結合形態(tài)學觀察和生理生化實驗，初步鑒定KQ46為Cupriaviduscampinensis。
　　以KQ46為供試菌株，利用mini-mariner轉座子對其進行了隨機插入突變，從5000個突變子中篩選到10株可以穩(wěn)定生長且鎘抗性能力降低突

3、變株，鎘耐受濃度分別由4mM降低到0.8-1.0mM。利用SEFAPCR方法擴增了每個突變株中轉座子的側翼序列，通過同源性比對分析，發(fā)現(xiàn)有6株突變株的轉座子插入的基因分別與aroG、ppd、alkK、ppc、細胞色素c533合成基因以及Acyl-CoA轉移酶基因高度同源，這6個基因均為基礎生長代謝所需要的基因;其余4株突變株中轉座子插入失活的基因分別可能為:hmp，與細胞抗逆性反應相關;hmyF，為重金屬離子外排的輔助蛋白;組氨酸激酶基

4、因，與細胞信號轉導有關;fcuA，鐵色素-鐵離子復合物的受體蛋白。
　　參考前人的研究結果后，認為fcuA可能與胞內Cd2+濃度調節(jié)有關，通過sau3AI隨機酶切建庫的方法獲得了KQ46中fcuA基因的全序列(GenBankAccessionNo.KC776916)及其部分側翼序列，構建了MT21的fcuA基因回補菌株DRfcuA。通過測定培養(yǎng)過程中菌株KQ46胞內Cd2+含量和培養(yǎng)基中Cd2+濃度并結合紅外光譜分析，發(fā)現(xiàn)胞內和胞

5、外Cd2+濃度在培養(yǎng)過程中基本維持恒定，培養(yǎng)12h和24h胞內鎘含量分別為0.548±0.016mg/g和0.552+0.008mg/g，進入衰亡期后細胞對Cd2+吸收增多，含量為1.038+0.046mg/g，而紅外光譜分析顯示細胞表面并沒有明顯吸附有Cd2+，由此認為菌株KQ46主要依靠外排Cd2+來維持胞內Cd2+含量處于可耐受范圍，從而產(chǎn)生鎘抗性。同時對MT21和DRfcuA研究后發(fā)現(xiàn)雖然MT21和DRfcuA對鎘的最大耐受濃度

6、均為0.8mM，但在含有0.5mMCd2+的培養(yǎng)條件下從掃描電鏡照片可以看出0.5mMCd2+對MT21毒害作用比DRfcuA明顯，DRfcuA吸收的Cd2+僅為MT21的50％左右，不過仍然顯著高于KQ46的吸收量，同時紅外光譜分析顯示在含有0.5mMCd2+的培養(yǎng)條件下MT21和DRfcuA的細胞在1735cm-1處具有紅外吸收峰，推測可能為細胞表面的酮、醛、酯類中的C=O鍵與Cd2+結合所致。由此分析認為fcuA基因在Cupria