基于核酸擴(kuò)增與雜交的口蹄疫病毒分型檢測(cè)方法研究.pdf

1、口蹄疫是一類急性、烈性的傳染病，其早期診斷及分型診斷不僅是疫情防控的關(guān)鍵，也是疫情發(fā)生時(shí)食品安全監(jiān)管的一項(xiàng)重要內(nèi)容。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)可以在恒溫條件下實(shí)現(xiàn)快速、高效、靈敏的核酸檢測(cè)，近年來(lái)多種肉眼可視以及儀器分析的檢測(cè)方法的應(yīng)用，使得該方法更加符合現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的需求。反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)可以同時(shí)進(jìn)行多個(gè)靶基因的并行檢測(cè)，在口蹄疫病毒的分型檢測(cè)中具有極大的優(yōu)勢(shì)，尤其是近年來(lái)隨著基因芯片技術(shù)的不斷發(fā)展，簡(jiǎn)化了操作程序，縮短了檢測(cè)時(shí)間，符合口蹄疫

2、病毒高通量檢測(cè)的需求。本論文以環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)和反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)為基礎(chǔ)，建立了兩種口蹄疫病毒的分型檢測(cè)方法，以滿足現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的需要，為口蹄疫病毒的防控提供簡(jiǎn)便、快速的技術(shù)保障，論文的主要內(nèi)容及結(jié)果如下:
　　 (1)篩選用于口蹄疫病毒分型檢測(cè)的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物。針對(duì)七種血清型口蹄疫病毒序列差別較大的VP1片段，設(shè)計(jì)并合成具有血清型特異性的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物。每組引物按照內(nèi)引物與外引物8∶1、內(nèi)引物與環(huán)引物2∶1的摩爾濃度比

3、配制成引物溶液，分別擴(kuò)增七種血清型口蹄疫病毒的重組質(zhì)粒，均僅有對(duì)應(yīng)血清型的模板出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果，具有良好的血清型特異性。
　　 (2)建立口蹄疫病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增分型檢測(cè)方法。利用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)系統(tǒng)和實(shí)時(shí)濁度檢測(cè)系統(tǒng)，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)擴(kuò)增過(guò)程中的信號(hào)變化，可以對(duì)O型、AsiaI型、A型、C型、SAT1型、SAT2型、SAT3型七種血清型口蹄疫病毒的重組質(zhì)粒和O型、AsiaI型、A型口蹄疫病毒的乳鼠傳代病毒進(jìn)行分型檢測(cè)。比較兩種

4、實(shí)時(shí)檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)七種血清型口蹄疫病毒重組質(zhì)粒的檢測(cè)靈敏度，實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)系統(tǒng)在20min內(nèi)即可檢測(cè)到1-100fg/μL的模板，用時(shí)和靈敏度均優(yōu)于傳統(tǒng)方法，而實(shí)時(shí)濁度檢測(cè)系統(tǒng)在30min內(nèi)可檢測(cè)到1-100pg/μL的模板，其靈敏度與傳統(tǒng)檢測(cè)方法相當(dāng)，但用時(shí)大大縮短。
　　 (3)建立口蹄疫病毒的室溫反向斑點(diǎn)雜交分型檢測(cè)方法。針對(duì)七種血清型口蹄疫病毒序列差別較大的VP1片段，設(shè)計(jì)并合成通用性擴(kuò)增引物和特異性寡核苷酸探針。以O(shè)型、As

5、iaI型、A型、C型、SAT1型、SAT2型、SAT3型七種血清型口蹄疫病毒的重組質(zhì)粒和O型、AsiaI型、A型口蹄疫病毒的乳鼠傳代病毒為模板，制備生物素標(biāo)記的目的片段，與固定在帶正電荷的尼龍膜上的特異性寡核苷酸探針進(jìn)行室溫雜交，雜交特異性好，且無(wú)交叉反應(yīng)。
　　 (4)口蹄疫病毒室溫反向斑點(diǎn)雜交分型檢測(cè)方法的優(yōu)化。當(dāng)探針濃度為100μmol/L，甲酰胺用量為5mL（20mL反應(yīng)體系），雜交時(shí)間為60min，酶促反應(yīng)時(shí)間為30m