嗜酸乳桿菌JQ-1胞壁蛋白酶的分離純化及其水解酪蛋白產(chǎn)ACE抑制肽的研究.pdf

1、研究發(fā)現(xiàn)，嗜酸乳桿菌發(fā)酵酪蛋白所制備的水解產(chǎn)物具有降血壓的功能，主要是由于乳桿菌的蛋白水解系統(tǒng)能分解酪蛋白產(chǎn)生活性多肽，這些多肽大都具有抑制血管緊張素轉(zhuǎn)移酶(Angiotensin I-Converting Enzyme，ACE)作用，從而達(dá)到降血壓等效果。本文就嗜酸乳桿菌JQ-1產(chǎn)胞壁蛋白酶的培養(yǎng)及發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，并進(jìn)行分離純化，水解酪蛋白條件優(yōu)化，及其水解對(duì)于酪蛋白結(jié)構(gòu)及功能特性的影響進(jìn)行了研究。
　　通過正交試驗(yàn)確定了嗜酸

2、乳桿菌JQ-1產(chǎn)胞壁蛋白酶的最優(yōu)培養(yǎng)條件：含2％葡萄糖和1%牛肉蛋白胨的MRS改良培養(yǎng)基。通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析法確定了嗜酸乳桿菌產(chǎn)胞壁蛋白酶的最佳發(fā)酵條件：初始pH值8.0、發(fā)酵溫度37℃、發(fā)酵時(shí)間20h。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明響應(yīng)面分析法對(duì)優(yōu)化產(chǎn)酶條件是可行的。
　　采用溶菌酶結(jié)合非離子表面活性劑法對(duì)胞壁蛋白酶進(jìn)行提取，得出其最佳提取條件為：菌粉與裂解液比例為1：5，33℃下保溫4.0h，離心取得的上清液即為粗酶液。通過聚乙二醇

3、-20000濃縮，DEAE-Sephadex A-25和Sephadex G-100兩步層析對(duì)粗酶液進(jìn)行分離純化，蛋白酶提純倍數(shù)達(dá)到50.951倍，最后回收率為12.569%，且SDS-PAGE檢測(cè)蛋白酶為單體結(jié)構(gòu)，分子量為45kD。用純化后CEP水解β-酪蛋白，水解液ACE抑制率為48%。
　　采用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面中心組合設(shè)計(jì)確定了嗜酸乳桿菌JQ-1胞壁蛋白酶水解β-酪蛋白的最優(yōu)條件，按[E]/[S](w/w)為0.08的量加

4、入蛋白酶，調(diào)pH至8.0，在42℃下酶解4h后滅酶活，最后產(chǎn)品ACE抑制率為72.91%，總肽含量為12.68mg/ml。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明響應(yīng)面分析法對(duì)于優(yōu)化酶解條件是可行的。掃描電鏡圖顯示β-酪蛋白酶解物的表面結(jié)構(gòu)緊密性逐漸減弱，并伴有較多小孔洞出現(xiàn)；差示掃描量熱法DSC表明酪蛋白酶解物具有較高的熱穩(wěn)定性；此外CEP酶解使得酪蛋白酶解物中游離巰基含量增加，同時(shí)導(dǎo)致其酶解物抗氧化性的增加。
　　FTIR分析表明 CEP酶解改變了酪

5、蛋白各種構(gòu)象所占的比例，酪蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了不同程度的變化；納米粒度分析表明酪蛋白顆粒大小隨水解的加深先減小后增大，其水解物顆粒在 DH4.5%時(shí)最小，乳化穩(wěn)定性最大；酪蛋白的乳化性隨水解的加深先增大后減小，DH7.1%時(shí)增至最大，與其溶解性的變化趨勢(shì)一致；此外酪蛋白的酶解物具有一定的ACE抑制活性及抗氧化性，且 DPPH清除能力在一定范圍內(nèi)隨水解度及濃度的增大而增大，當(dāng) DH為8.3%，濃度為5mg/ml時(shí)，DPPH清除能力增大至35